|
Proteins bài tiết và
liên kết màng
Chia cắt phân giải protein
Glycoproteins
Cơ
chế liên kết đường
Xác
định mục tiêu lysosomal của enzymes
Sự
có ý nghĩa lâm sàng của Glycoproteins
Khuyết tật phân huỷ Glycoprotein
Acyl-hoá
Methyl-hoá
Phosphoryl-hoá
Sulfate-hoá
Prenyl-hoá
Biến đổi lệ thuộc
Vitamin C
Biến đổi lệ thuộc
Vitamin K
Selenoproteins
Proteins bài tiết và
liên kết màng
Proteins, là màng
liên kết hoặc được chỉ định trong việc bài tiết được tổng hợp
bởi ribosomes liên kết với những màng của mô lưới nội chất (ER).
ER liên kết với ribosomes được gọi là ER thô (RER). Lớp protein
này tất cả có một đầu N- được gọi là một chuỗi tín hiệu hoặc
peptide tín hiệu. Peptide tín hiệu thường là 13-36 chất tồn lưu
kỵ nước nổi bật. Peptide tín hiệu được nhận biết bởi một phức
protein nhiều yếu tố được gọi là hạt nhận biết tín hiệu (SRP).
Peptide tín hiệu này bị lấy đi tiếp theo đi qua màng mô lưới nội
chất. Việc lấy đi peptide tín hiệu được xúc tác bởi peptidase
tín hiệu. Proteins có một peptide tín hiệu được gọi là
preproteins để phân biệt chúng với proproteins. Tuy nhiên, vài
proteins được trù định cho việc bài tiết cũng được phân giải
proteins thêm tiếp theo bài tiết và, vì thế có chuỗi trước (pro
sequences). Lớp protein này được gọi là preproproteins.
Cơ chế tổng hợp màng
liên kết hoặc bài tiết proteins. Ribosomes cam kết màng ER thông
qua phản ứng tương hỗ của hạt nhận biết tín hiệu, SRP trên
ribosome có thể nhận cảm SRP trên màng ER. Khi protein được tổng
hợp chuỗi tín hiệu được đi qua màng ER vào trong lumen của ER..
Sau tổng hợp đầy đủ peptide tín hiệu bị lấy đi bởi hành động của
peptidase tín hiệu. Sự tổng hợp sẽ tiếp tục và nếu protein được
bài tiết nó sẽ kết thúc hoàn toàn trong lumen của ER. Nếu
protein là màng liên kết thúc một mô típ chuyển giao kết thúc
trên protein sẽ kết thúc chuyển giao protein thông qua màng ER.
Điều này sẽ trở thành màng nối miền của protein.
Phương pháp chia cắt
phân giải protein
Nhiều proteins tiến
hành chia cắt phân giải protein theo sau dịch mã. Hình thức giản
đơn nhất của điều này là việc lấy đi methionine bắt đầu. Nhiều
proteins được tổng hợp như chất tiền tố bất động được hoạt hoá
trong những điều kiện sinh lý thích hợp bởi phân giải protein
giới hạn. Enzymes của tuyến tuỵ và những enzymes liên quan kết
von là những ví dụ của điều trình bày sau. Những proteins tiền
tố bất động được hoạt hoá bằng cách lấy đi polypeptides được gọi
là proproteins.
Một ví dụ phức tạp
của quá trình hậu dịch mã của một proprotein là sự chia cắt
prepro-opiomelanocortin (POMC) tổng hợp trong tuyến yên (xem
trang Peptide Hormones trong phần thảo luận về POMC).
Preproprotein này tiến hành chia cắt phức tạp, đường dẫn của
chất khác nhau lệ thuộc vào vị trí của tế bào của tổng hợp POMC.
Một ví dụ khác là
một preproprotein là insulin. Vì insulin được bài tiết từ tuyến
tuỵ nó có một prepepride. Tiếp theo sự chia cắt peptide tín hiệu
amino acid 24 protein xếp thành proinsulin. Proinsulin được chia
cắt thêm cho insulin hoạt động gồm có hai chuỗi peptide liên kết
với nhau qua liên kết disulfide.
Lại những proteins
khác (của lớp enzyme) được tổng hợp như chất tiền tố không hoạt
động được gọi là zymogens. Zymogens được hoạt hoá bởi chia cắt
phân giải protein như là tình huống trong vài proteins của thác
đông máu
Glycoproteins
Màng liên kết
carbohydrate độc quyền ở dưới hình thức oligosaccharides cùng
hoá trị liên kết với proteins tạo ra glycoproteins, và chừng mực
cùng hoá trị liên kết với lipid tạo ra glycolipids.
Glycoproteins gồm có proteins cùng hoá tri liên kết
carbohydrate. Những đường nổi bật tìm thấy trong glycoproteins
là glucose, galactose, mannose, fucose, GalNac, GlcNAc và
NANA.Sự riêng biệt giữa proteoglycans và glycoproteins thường
trú trong chừng mực và kiểu biến đổi carbohydrate. Những biến
đổi carbohydrate tìm thấy trong glycoproteins ít phức tạp:
carbohydrates được liên kết với thành phần protein thông qua có
hoặc không liên kết O- glycosidic hoặc N-glycosidic. Sự liên kết
N-glycosidic thông qua nhóm amide của asparagine. Sự liên kết
O-glycosidic với hydroxyl của serine, threonine hoặc
hydroxylysine. Sự liên kết của carbohydrate với hydroxylysine
thường được tìm thấy chỉ trên collagens. Sự liên kết của
carbohydrate với 5-hydroxylysine có hoặc không đường galactose
riêng hoặc díaccharide glycosygalactose. Trên glycoproteins liên
kết O- kiểu ser- hoặc thr-, carbohydrate trực tiếp gắn với
protein là GalNAc. Trên glycoproteins liên kết N, đó là GlcNAc.
Sự liên kết
carbohydrate nổi bật trên glycoproteins cuả tế bào động vật có
vú là thông qua liên kết N-glycosidic. Điểm liên kết
carbohydrate với glycoproteins liên kết N được tìm thấy trong
chuỗi liên ứng của amino acids, N-X-S(T), nơi X là amino acid
bất kỳ trừ proline. Khi một phân tích proteins trong cơ sở dữ
liệu công cộng được thực hiện, điều này có thể được trình bày là
ước chừng 65% của mọi proteins có ít nhất một lần xuất hiện
glycỏpoteins liên kết N liên ứng Asn-X-Ser/Thr tất cả đều có một
lõi chung của carbohydrate gắn với polypeptide. Lõi này gồm có
ba chất tồn lưu mannose và hai GlcNAc. Nhiều đường khác gắn với
lõi này và gồm có ba họ liên kết N chính.
1. Kiểu mannose liều
lượng cao gồm có tất cả mannose bên ngoài lõi với những liều
lượng khác nhau.
2. Kiểu lai có nhiều
đường và đường amino.
3. Kiểu phức giống
như kiểu lai, nhng ngoài ra, có sialic acids ở chừng mực khác
nhau.
Cấu trúc của oligosaccharides của 3 lớp chính glycoprotein
Vuông mở: GlcNAc;
vòng tròn mở: mannose; kim cương mở: galactose; vuông đầy:
fucose; tam giác đầy: sialic acid; những ký hiệu Hi Lạp “ và “
theo sau bởi số liên quan kiểu liên kết.
Nhiều proteins được
bài tiết, hoặc liên kết với màng plasma, được biến đổi bởi gắn
kết carbohydrate. Bộ phận được biến đổi, trên proteins liên kết
màng plasma, là phần ngoại bào của protein được sửa đổi. Những
proteins nội bào thường ít bị biến đổi bởi liên kết
carbohydrate. Tuy nhiên, liên kết của carbohydrate với proteins
nội bào mang những hoạt động chức năng độc nhất trên những
proteins này.Sự liên kết của carbohydrate với cytosolic và/hoặc
proteins hạch xuất hiện thông qua liên kết O và liên quan liên
kết của GlcNAc với những chất tồn lưu serine hoặc threonine. Sự
liên kết được xúc tác bởi enzyme O-GlcNAc transferase, OGT. Vài
yếu tố phiên mã và RNA polymerase II đã được trình bày sẽ được
biến đổi bởi liên kết O-GlcNAc.
Cơ chế liên kết
carbohydrate với protein
Thành phần protein
của tất cả glycoproteins được tổng hợp từ polyribosomes liên kết
với mô lưới nội chất (ER). Việc xử lý nhóm đường xuất hiện cùng
dịch mã trên lumen của ER và tiếp tục trong máy Golgi trong
glycoproteins liên kết N. Liên kết của đường trên glycoproteins
O xuất hiện sau dịch mã trên máy Golgi. Đường dùng trong tổng
hợp glycoprotein (liên kết N- và liên kết O-) được hoạt hóa bằng
cách ghép đôi với nucleotides. Glucose và GlcNAc được ghép đôi
với UDP và mannose được ghép đôi với GDP.
Đường liên kết O:
Việc tổng hợp glycoproteins liên kết O xuất hiện thông qua việc
thêm từng nước đường hoạt hóa nucleotide trực tiếp trên
polypeptide. Những đường hoạt hóa nucleotide được ghép đôi với
UDP, GDP (như với mannose) hoặc CMP (ví dụ NANA). Việc liên kết
đường được xúc tác bởi glycoprotein glycosyltransferases. Chứng
cứ chỉ dấu là mỗi kiểu đặc biệt của liên kết carbohydrate trên
glycoproteins liên kết O là kết quả của một glycosyltransferase
khác nhau.
Đường liên kết N:
Như đã chỉ dấu trước, ba lớp chính biến đổi carbohydrate liên
kết N là mannose cao, lai và phức. Đặc tính phân biệt biệt chính
của lớp phức là sự hiện diện của sialic acid, nhưng trái lại lớp
lại không có sialic acid.
Ngược lại với việc
thêm từng bước nhóm đường vào lớp liên kết O- của glycoproteins,
tổng hợp glycoprotein liên kết N- đòi hỏi một trung gian lipid:
dolichol phosphate. Dolichols là những polyprenols (C80-C100) có
17 đến 21 đơn vị isoprene, trong đó đơn vị đầu bảo hòa.
Dolichol
Dấu ngoặc đen cho
biết đơn vị isoprene. Phosphate trên dolichol phosphate được gắn
với hydroxyl.
Như đã chỉ dấu, sự
hình thành liên kết GlcNAc--Asn
trên proteins xuất hiện trên mô lưới nôi chất (ER) thông qua
việc thêm cùng dịch mã của một cấu trúc lõi carbohydrate tập hợp
trước được cấp thông qua trung gian lipid carbohydrate dolichol.
Cấu trúc lõi carbohydrate tập hợp trước gồm có ba chất tồn lưu
đầu của glucose liên kết với một nhóm phân cành của 9 chất tồn
lưu mannose đến lượt liên kết với hai chất lưu tồn GlcNAc gắn
với dolicholpyrophosphate. Cấu trúc được viết gọn
Glc3Man9GlcNAc2-P-P-dolichol. Cấu trúc này thường được tham khảo
như là oligosaccharide liên kết lipid (LLO), nhưng trái lại cấu
trúc oligosaccharide chính nó được gọi là oligosaccharide en
bloc (theo khối lượng). Trên những tế bào của động vật có vú tầm
quan trọng của chất tồn lưu cuối hiển nhiên phát sinh từ sự việc
là sự chuyển giao của Man9GlcNAc1-P-P-dolichol gấp 25-lần ít
hiệu quả so với cấu trúc hoàn hoàn. Ngoài ra, những cấu trúc có
ba chất tồn lưu glucose cuối, nhưng không cấu trúc hoàn toàn
Man9GlcNAc2, được chuyển giao có hiệu quả sang protein bởi
oligosaccharyltransferase. Sự tổng hợp đơn vị en bloc
dolichol-P-P-oligosaccharide bắt đầu trên mặt tế bào chất của
màng ER và trước khi chuyển giao sang protein, cấu trúc "búng"
qua phia lumen.
Ngay sau khi chuyển
giao đơn vị en bloc oligosaccharide sang protein, việc xử lý và
làm thay đổi thành phần oligosaccharide xảy ra và tiếp tục khi
protein đi qua ER sau đó đi vào và qua máy Golgi. Ban đầu,
glucose cuối bị lấy đị qua hành động của glucosidase I (GI), một
enzyme liên kết màng nhận biết glucose liên kết
1,2.
Hai chất tồn lưu glucose còn lại sau đó bị lấy đi b[it
glucosidase II (GII), một enzyme hòa tan của chất tồn lưu
glucose, tác động của những a-mannosidases lấy đi vài chất tồn
lưu mannose khi protein tiến dần về Golgi. Tác động của nhiều
glucosidases và mannosidases để lại những glycosidases liên kết
N có một lõi chung của carbohydrate gồm có ba chất tồn lưu
mannose và hai GlcNAc. Thông qua tác động của nhiều
glucosyltransferases và glucosidases, nhiều đường khác được gắn
vào lõi này khi protein tiến dần qua Golgi. Những phản ứng sau
phát sinh ba họ chính của gluoproteins liên kết N trình bày
trên.
Xác định mục tiêu
lysomosal của enzymes
Enzymes được trù
định trước cho lysosomes (lysosomal enzymes) được định hướng ở
đó bởi một biến đổi carbohydrate đặc biệt. Trong quá trình
trung chuyển qua máy Golgi một chất tồn lưu của
GlcNAc-1-phosphate (GlcNAc-1-P) được thêm vào nhóm carbon-6
hydroxyl của một hoặc nhiều hơn chất tồn lưu mannose đặc biệt đã
được thêm vào những enzymes này. GlcNAc được hoạt hóa bởi việc
ghép đôi với UDP và được chuyển giao bởi UDP-GlcNAc:lysosomal
enzyme GlcNAc-1-phosphotransferase (GlcNAc-phosphotransferase),
cho một trung gian phosphodiester: GlcNAc-1-P-6-Man-protein. Một
phản ứng thứ hai (xúc tác bởi GlcNAc
1-phosphodiester-N-acetylglucosaminidase lấy đi GlcNAc để lại
chất tồn lưu mannose phosphoryl-hóa ở vị trí 6: Man-6-P-protein.
Một chất nhận đặc biệt Man-6-P receptor (MPR) hiện diện trên
những màng của máy Golgi. Kết nối Man-6-P với thể nhận này xác
định mục tiêu cho proteins đi đến lysosomes.
Hai MPRs riêng biệt
đã được nhận diện và cả hai là thành phần của họ lectin kiểu P.
Cả hai là glycoproteins màng hoàn toàn kiểu I có một miền ngoại
bào đầu N-riêng, và một dịch màng riêng và một miền tế bào chất
đầu C-. Một thể nhận lớn có một trọng lượng nguyên tử khoảng 300
kDa, một thể nhận khác nhỏ có một trọng lượng phân tử khoảng 46
kDa. Tính đồng nhất cấu trúc giữa hai thể nhận này chỉ dấu chúng
phát sinh từ một gien tổ tiên riêng có thể nhận lớn phát sinh
qua việc sao gien nhiều yếu tố. Phần ngoại bào của thể nhận lớn
có 15 yếu tố đang lập lại, mỗi yếu tố trong số đồng nhất cao với
miền ngoại bào của thể nhận nhỏ. Cả hai thể nhận hiện có như là
dimers (chất nhị phân) gắn vào màng.
Thể nhận lớn liên
kết hai mols của Man-6-P và thể nhận nhỏ liên kết một mole
Man-6-P mỗi đơn vị phụ, vì thế 4 và 2 moles của Man-6-P mỗi
dimer, tương ứng. Những phiên bản của bò và của chuột của thể
nhận nhỏ cần cations lưỡng trị trong việc liên kết cột thắt và
vì thế thể nhận được gọi là thể nhận Man-6-P lệ thuộc cation
(CD-MPR). Tuy nhiên, đối tác người có thể không cần cations cho
hoạt động của nó. Thể nhận lớn không đòi hỏi cations lưỡng trị
trong liên kết cột thắt và vì thế, thường được tham khảo như thể
nhận Man-6-P không lệ thuộc cation (CI-MPR). Tuy nhiên, CI-MPR
đã được trình bày liên kết homon polypeptide phi-glycosyl-hóa,
yếu tố phát triển II giống insulin (IGF-II) và như trên MPR
thường được nhận diện nhiều hơn như IGF-II/MPR. IGF-II/MPR có
thể ử dụng ở trên mặt tế bào và vai trò của nó trong việc liên
kết IGF-II là để xác định mục tiêu homon này trong việc phân hủy
trong lysosomes. Thêm vào IGF-II, IGF-II/MPR đã được trình bày
trong việc liên kết nhiều Man-6-P có proteins cũng như vài
proteins phi-glucosyl-hóa. Mặc dù IGF-II/MPR và CD-MPR thể hiện
những hoạt động riêng biệt, cả hai thể nhận hoạt động xác định
mục tiêu enzymes lysosomal mới tổng hợp với lysosomes.
Sự có ý nghĩa lâm
sàng của Glycoproteins
Glycoproteins trên
bề mặt tế bào quan trọng trong việc thông tin giữa những tế bào,
để bảo quản cấu trúc tế bào và trong việc tự nhận biết bởi hệ
thống miễn nhiễm. Sự thay đổi của glycoproteins trên bề mặt tế
bào có thể, vì thế, tạo ra hiệu ứng sinh lý sâu, trong đó vài
hiệu ứng được trình bày dưới đây.
1. Kháng thể của
nhóm máu ABO là những nửa carbohydrate của glucolipids trên bề
mặt của tế bào cũng như phần carbohydrate của glycoproteins
huyết tương. Khi hiện diện trên bề mặt tế bào của carbohydrates
ABO được liên kết với lớp sphingolipid và vì thế của lớp
glycosphingolipids. Khi carbohydrates ABO được liên kết với
protein dưới hình thức glycoproteins chúng được tìm thấy trong
huyết tương và được tham khảo như hình thức bài tiết. Vài cá thể
tạo ra những hình thức glycoprotein của kháng thể ABO trong khi
những cá thể khác thì không. Đặc tính này phân biệt những thể
bài tiết với những thể không bài tiết, một đặc tính có tầm quan
trọng pháp lý như là trường hợp cưỡng hiếp. Để biết thêm chi
tiết về kháng thể nhóm máu, gồm có ABO vào trang website SCARF.
Phương pháp sửa đổi hậu dịch mã- Chuỗi peptide
Lần trước tôi đã nói
về phương pháp sửa đổi proteins, hôm nay tôi sẽ bắt đầu nói về
phương pháp hậu dịch mã. Phương pháp sửa đổi dịch mã và hậu dịch
mã, sửa đổi hóa học protein, và phát sinh đột biến có định hướng
điểm có thể ở một chừng mực sâu được nhóm lại với nhau; chúng là
tất cả những phương pháp tạo ra một protein, điều gì khác nhiều
hơn là điều mà gien kiểu hoang đã mô tả đặc tính, với mã của nó
trong 20 amino acids "tự nhiên". Hai phương pháp sâu nhất chia
chúng là, có hoặc không sửa đổi dịch mã – trong quá trình tổng
hợp protein thường bởi ribosomes- hoặc hậu dịch mã, sau khi tổng
hợp chuỗi protein? Có hoặc không phương pháp sửa đổi tự nhiên,
điều mà chúng ta quan sát trong thiên nhiên, điều mà chúng ta
làm cho protein để tìm ra nhiều hơn về làm cách nào protein tự
nhiên hoạt động, hoặc để cải tiến phương pháp hoạt động của nó,
tính ổn định của nó hoặc hiệu quả? Những sửa đổi hậu dịch mã có
thể được chia thêm thành sửa đổi những chuỗi phụ và sửa đổi
chuỗi peptide, bao gồm việc phân giải protein- ví dụ, tạo ra
insulin từ proinsulin, sự hoạt hóa proteases- nà còn những sửa
đổi của amino và đầu carboxyl, sắp xếp lại chuỗi protein, và cả
đảo đoạn của một amino acid, L đến D.
Chúng tôi đã trình
bày từ trước những thay đổi dịch mã, tự nhiện hoặc nhân tạo, sửa
đổi hóa học chuỗi phụ, và vài sửa đổi tự nhiên chuỗi phụ. Hôm
nay tôi sẽ nói về những sửa đổi liên quan chuỗi peptide chính,
đưa đến protein có chuỗi khác nhau so với chuỗi mã hóa bởi gien;
điều đáng chú ý nhất của những chuỗi này, việc cắt hoặc nối
chuỗi protein trong được gọi là inteins, phần lớn được khám phá
ở Phòng Thí nghiệm Sinh học New England và được chuyển chúng vào
sản phẩm- Tôi đang cho bạn vật bay của chúng trên đề tài. Phần
trình bày sau tôi sẽ nói về sửa đổi hậu dịch mã tự nhiên, như
với sửa đổi hóa học, tôi không thể nói mọi điều, nhưng tôi sẽ
cho bạn những bản sao của bản nội dung của ba cuốn sách Những
Phương pháp trong Enzym học (=Methods in Enzymology) vì ít nhất
một danh sách những sửa đổi hiện nay đã biết. Tôi sẽ nói về
prenyl-hóa và acyl-hóa chất béo, là những đề tài nóng hiện nay,
và tôi hi vọng về việc trao đổi lẫn nhau liên kết disulfide, có
tầm quan trọng cơ bản.
Những thay đổi tự
nhiên có thể được phân loại thêm theo ít nhất hai phương pháp:
hoặc trao đổi qua lại hoặc không trao đổi qua lại, và thay đổi
những đặc tính của protein- những cấp hạng cuối này không tách
riêng hoàn toàn. Phương pháp sửa đổi qua lại như là
phosphoryl-hóa thường thực hiện với mục đích kiểm tra, để hoạt
hoá hoặc khử hoạt hoá một enzyme, tuy nhiên có vài qui trình
trao đổi không qua lại, đặc biệt là sự hoạt hóa proteases bằng
cách chia cắt một liên kết peptide. Vài sửa đổi như là
glycosid-hóa, prenyl-hóa và acyl-hóa chất béo hình như sẽ là để
xác định phương hướng đến một vị trí đặc biệt trong hoặc ngoài
tế bào, như trong màng tế bào. Trong nhiều tình huống, như là
chuyển giao một nửa aminobutyl đặc biệt vào yếu tố bắt đầu
eIF-5A và sự hydroxyl-hóa của nó để tạo ra một chất tồn lưu
hypousine, mà Dr K.Y. Chen đang nghiên cứu, chúng tôi không biết
điều gì là chức năng sửa đổi, nhưng điều đó phải là quan trọng,
khi bị gián đoạn, gây tử vong.
Tôi bắt đầu với
những sửa đổi những đầu N- và C- của protein. Những chuỗi
polypeptide được tổng hợp bắt đâù với formylmethionine, nhưng
nhóm formyl luôn, và dĩ nhiên thường là methionine, bị lâý đi
trong protein trưởng thành. Khá thường là protein trưởng thành
có đầu amino acetyl-hoá, thường là nếu amino acid là alanine
hoặc serine, thỉnh thoảng glycine, methionine hoặc aspartic
acid; nghĩa là một đau nhức bạn đang cố gắng xác định chuỗi đầu
của amino bởi sự phân huỷ Edman. Glutamine đầu amino thường chu
kỳ hoá để tạo ra pyroglutamic acid, trong đó nhóm amino-
thay nitrogen tách riêng trong liên kết amide với carboxyl-
.
Thỉnh thoảng điều này là một sản phẩm của protein, nhưng thường
điều này là thật. Một sửa đổi khác của đầu amino, như của các
chuỗi phụ lysine, histidine, và arginine là sự methyl-hoá. Trong
vài proteins vi sinh, như là histidine decarboxylase của
Lactobacillus và Clostridium perfringens, serine hoặc
threonine của đầu amino bị khử amin để phát sinh một pyruvol
hoặc đầu ketobutyryl-
,
chất này được sử dụng như một đồng dạng của pyridoxal
5'-phosphate trong hiện tượng chuyển amin-hoá amino acid và phản
ứng carboxyl-hoá. Enzyme được tổng hợp như một protein tiền tố
bất động với một chuỗi Ser-Ser, carboxyl của serine đầu chuyển
dịch đến hydroxyl-
và sau đó bị loại, sử dụng oxy với nó và để lại một chất tồn lưu
aminocrylate-
,
liên kết đôi chắc là chuyển dịch về nitrogen, cho một imino acid
và =NH dễ thay bởi Oxy từ nước, cho keto acid cuối. Chuỗi trước
khi chia vẫn là phức trưởng thành như một đơn vị phụ tách riêng
(phức hiện là một thể năm (pentamer) có hai mỗi trong những đơn
vị phụ nhỏ và lớn này). Nhóm-
cũng phản ứng với đường, như trong glucuronylglycine trong vài
enzyme vi sinh và và glycyl-hoá phi-enzym khi số lượng đường
trong máu cao trên những bệnh nhân tiểu đường.
Có nhiều trường hợp
trong đó nhóm carboxyl đầu C của polypeptide được qui đổi thành
một amide. Không có nhiều sửa đổi khác của đầu C, dù có sự lấy
đi vài amino acids liên kết với farnesyl-hoá hoặc
geranylgeranyl-hoá của một chuỗi phụ cystein ba chất tồn lưu
trong và từ đầu C, mà tôi sẽ nói về liên quan phản ứng đó.
Cũng có những trường
hợp trong đó một amino acid phụ, phần lớn thường là arginine,
được đặt trên một protein tổng hợp, thường là ở đầu amino nhưng
trong một trường hợp ở đầu C (tyrosine thêm vào tubulin), thường
là từ tRNA có điện tích, nhưng không có ribosomes hoặc mã di
truyền, kết quả là một protein có một chuỗi như thường nhưng gồm
có một amino acid không tìm thấy trong gen! Điều này cũng có thể
thực hiện một cách nhân tạo. Một protein có thể được chia ở một
vị trí đặc biệt bởi một protease đặc biệt, một amino acid đơn ở
đầu C mới bị lấy đi bởi một carboxypeptidase, và protein đã ủ
trong một dung môi hữu cơ với một protease ổn định trong điều
kiện đó và một nồng độ cao của một amino acid khác. Trong những
điều kiện này phân chia phân giải protein chạy ngược chiều, vì
nước ở một nồng độ thấp ít hơn là 55 M, và amino acid thêm được
chèn và liên kết peptide tái tạo lại.
Chủ yếu tôi muốn nói
về những điều xuất hiện ở liên kết peptide. Dĩ nhiên trường hợp
giản đơn nhất là việc lấy đi methionine đầu-N gốc, trường hợp
giản đơn nhất kế tiếp là việc xử lý những peptides tín hiệu. Đây
là một đề tài chính một toàn bộ bài giảng chính có thể được
dùng, và bạn có thể tìm thấy nó trong những sách giáo khoa sinh
hoá học đại cương. Polypeptide khi được tổng hợp gồm có một
chuỗi đầu amino giàu amino acids kỵ nước, có thể liên kết đến
hạt nhận biết tín hiệu và được cấp cho màng của mô lưới nội nhũ,
nơi glycosyl-hoá xảy ra và peptide tín hiệu được chia hết. Hoặc
chất protein trước này đi đến hoặc vào màng tế bào của thể hạt
sợi hoặc hạt lục. Trong những trường hợp này peptide tín hiệu
được chia hết trong hai giai đoạn, một trong khi đi qua màng
ngoài đến không gian màng gian, một di từ màng trong, chỉ khi cả
hai chuỗi tín hiệu bị lấy đi nó xếp thành cấu trúc cuối của nó.
Hoặc, như với cytochrome (sắc bào) c1 protein có thể đi trước
hết đến thể mẹ trong màng trong, sau đó trở lại không gian màng
gian. Có một peptidase tín hiệu đặc biệt, hoặc vài, nhận biết
một chuỗi đặc biệt của peptide tín hiệu để chia nó, bởi những
máy vi tính hiện nay được lập trình để nhận biết điều này trong
một chuỗi gien. Chứng cứ của một peptide tín hiệu nhận bằng cách
so sánh chuỗi amino acid của protein trưởng thành với điều đó từ
gien, chuỗi tín hiệu là sự khác biệt.
Một đề tài khác rộng
nhiều hơn là sự chia của một hình thức chất tiển tố, gọi tên là
tiền-protein, để cho hình thức hoạt động cuối. Ngay trong 20 năm
qua có một cuốn sách rất lớn, Proteases and Biological Control
(Proteases và kiểm tra sinh học) về đề tài này. Những trường hợp
cổ điển là sự hoạt hoá chymotrypsinogen đến chymotrypsin và sự
hình thành homon của peptide như là insulin. Chymotrypsinogen
được tổng hợp trong tuyến tuỵ như là chymotrypsin zymogen không
hoạt động và bài tiết vào trong ruột dưới hình thức này. Sự phân
chia tới hạn, bởi trypsin, là liên kết peptide arg15-ile16, thả
nhóm amino-
của ile16 để phản ứng tương hỗ với chuỗi phụ carboxyl của
asp-184; điều này cho phép những thay đổi thích ứng nhỏ làm cho
những điểm hoạt động, hoạt động theo những phương pháp tôi sẽ
trình bày sau. Hình thức này được gọi là chymotrypsin-,
peptide cuối của amino vẫn được gắn với phần còn lại của protein
bởi một liên kết disulfide của cys1. Việc phân chia phân giải
protein thêm nữa lấy đi ser14-arg15, cho
-chymotrypsin,
và những phân chia khác lấy đi thr147-asn148, cho sản phẩm cuối
-chymotrypsin,
hình thức thường được khảo nghiệm.
Insulin được tổng
hợp như một chất tiền-protein 105 amino acids dài. Một peptide
tín hiệu 24-a được khi nó đi vào mô lưới nội nhũ, cho chất
tiền-insulin. Điều này xếp và tạo ra những liên kết disulfide
giữa cysteins 7 và 67 và giữa 19 và 80. Một protease giống
trypsin phân chia arg31 và arg80. Chuỗi 32-60 đi xa, và arg31
được cắt tỉa hết bởi một carboxypeptidase để cho insulin trưởng
thành, với những chuỗi A và B giữ chung nhau bởi liên kết
disulfide. Điều này sẽ không xếp lại một cách tự nhiên trên việc
làm giảm disulfides, vì việc xếp thông tin trong chuỗi 32-60
không còn hiện diện nữa. Homon của peptide và những peptides
hoạt động sinh học khác thường được tạo ra một cách giống nhau,
bằng cách cắt hết một protein lớn tổng hợp đầu, ví dụ, chất tiền
tố proproopiomelanocortin có thể cho, trên những phân chia khác
nhau, corticotropin
-
và g-lipotropin, a-, b- và g-MSH, enkephalin và endorphin.
Điều này đúng là sự
chia những liên kết peptide, có thể hoặc không thể hình thành
những liên kết peptide mới? Hiển nhiên là chúng có thể, vài
trường hợp được tóm tắt bởi Coooper và Stevensii(2). Trong vài
trường hợp, đáng chú ý là protein RecA của Mycobacterium
tubercolusisiii (3) và đơn vị phụ xúc tác Tfp1p
của H+ khổng ATPase của Saccharomyces cerevisiae
(men)iv (4), protein có cùng kích thước như trên
những vi sinh khác, nhưng khung đọc mở (ORF) trên gien thì lớn
nhiều hơn, và tính đồng nhất ở đầu và cuối chuỗi. Điều này có
thể là do việc hiệu chỉnh RNA, nhưng chỉ RNA đã quan sát là kích
thước mong đợi từ ORF. Trong trường hợp vi sinh điều này được
trình bày là việc dịch mã đưa đến một bản sao mỗi bản sao có 69
kDa Tfp1p và của một protein đệm 50 kDa. Những mất đoạn trong xê
dịch khung trong miếng đệm đưa đến một protein cụt, phần cuối
NH2 của protein trưởng thành + phần của miếng đệm, trong khi mất
đoạn của một codon hoàn toàn vẫn cho một protein trưởng thành.
Việc tạo ra peptide thích hợp của protein trưởng thành cho một
chuỗi chạy qua điểm nối, chứng tỏ là có thể có một liên kết
peptide đã hình thành. Trong cả hai trường hợp việc nối thay một
cystein từ đầu amino của miền cuối C- trong một cystein của
miếng đệm (spacer).
Lectin nổi tiếng
(protein liên kết carbohydrate) concanavalin A làm nhiều hơnv(5).
Chất này được tổng hợp như một chất tiền tố 261-a-a đi vào mô
lưới nội nhũ. Ở đây nó bị kẹp ở những chất tồn lưu 119 và 130,
peptide nhỏ đi xa, nhưng hình thức chuỗi hai được xếp lại một
cách thích hợp và liên kết carbohydrates. Trong hình thức xếp
đầu amino là chất tồn lưu rất gần 252; chất này thay thế nhóm
amino của chất tồn lưu 253, với việc tạo ra một liên kết peptide
mới. Kế tiếp peptide 131-134 bị cắt xén. Vì thế protein trưởng
thành có chất tồn lưu gốc 135 khi đầu amino và chất tồn lưu gốc
119 giống như đầu C-. Concanavalin A thực hiện trên E. coli với
một peptide tín hiệu vi sinh gắn kết đi đến không gian chất bao
và không sắp xếp lại, nhưng một proteinlieen quan ở lại trong tế
bào chất không sắp xếp lại theo phương pháp này. Tất cả những
thay đổi xuất hiện ở phía carboxyl của một asparagine, những
chất tồn lưu tiếp theo không được mô tả đặc tính trong báo cáo
của Cooper và Stevens. Điều này hiện nay đã được biết là chất
tồn lưu trên phía đầu C- của sự phân chia luôn là một cysteine,
serine hoặc theorine.
Trường hợp được khảo
nghiệm nhiều nhất là DNA polymerases từ cổ sinh vật ưa nước
Thermococcus littoralis và Pyrococcus sp. GB-D, mà Francine
Perler ở Phòng Thí nghiệm Sinh học New England đang cố gắng vô
tính. Tính đồng nhất của gien với DNA polymerases khác cho biết
trên Thermococcus hai chuỗi xenvi (6), (những chuỗi
này hiện nay được gọi là inteinsvii (7) bởi tính đồng
nhất với introns; những mảnh nối với nhau được gọi là exteins),
và biểu hiện của gien trên E. coli cho một chất hỗ
độn. Việc lấy đi một trong những inteins đưa đến polymerase 90
kDa mong đợi và một protein 45 kDa tiêu biểu intein khác. Điều
này là tính đồng nhất chuỗi với việc tạo nơi trú ẩn cho
endonucleases mã bởi introns và lắp đặt chuỗi DNA của chúng
trong những gien có alen thiếu introns, và trong vài trường hợp
hoạt động của endonucleases đã được trình bày, hình như là có
liên quan trong việc di chuyển chuỗi DNA intein chung quanh bộ
genome của sinh vật.
Nhóm Perler đã khảo
nghiệmviii (8) Pyrococcus intein bằng cách lắp đặt nó
trong một gien ghép trong protein liên kết maltose + paramyosin
DSa1,
những proteins có miền liên kết maltose có thể được tinh chế
bằng sự hấp thụ trên amylose. Để cho E. coli tổng hợp
protein qua đêm ở 12o=20o tạo ra nhiều
protein ghép 132 kDa ba-phần, MIP, cũng như một hình thức 180
kDa hiển nhiên họ đặt tên là MIP*, và sản phẩm chia ở những đầu
N- hoặc C- của intein (M+IP, MI+P). Giả định MIP có thể tích tụ
vì nhiệt độ đến nay dưới nhiệt độ phát triển của chất ưa nhiệt
từ đó nó đến. Việc hâm nóng chất tiền tố MIP đến 37o
đưa đến việc nối, cho chủ yếu protein-paramyosin liên kết nối
(MP) + intein (I), cùng với vài IP. Việc nối nhânh nhất ở pH 6,
chậm lại ở pH cao nhièu hơn. Hình thức di trú chậm, MIP*, là một
trung gian phân cành của phản ứng nối, chất này có hai chuỗi đầu
amino, những chất của protein liên kết maltose và intein. Ở pH
cao (10) nó quay lại hình thức tuyến tính MIP.
Việc nối MIP thực
hiện trên E. coli và tinh chế bởi sắc ký trên amylose chỉ
dấu là chất này không yêu cầu bất kỳ enzym khác, chỉ chuỗi
intein, theo sau bởi serine, cysteine hoặc trong một trường hợp
threonine, cần để có thể nối. Giả định là intein xếp để mang
những điểm nối trong vùng lân cận gần, và giả định cấu trúc
extein phải cho phép việc xếp này. Chuỗi intein bắt đầu với một
cys hoặc ser và kết thúc, trong bảy inteins đã biết, với ba
amino acids kỵ nước, sau đó hisasn (Vài inteins “giả định” khác
đã được tìm thấy bởi tính đồng nhất chuỗi, tuy nhiên có một
glycine, hoặc trong một trường hợp một phenylalanine thay vì
histidine. Điều này không kiết có hoặc không những inteins giả
định của chúng hiện nay nối). Intein thả đã được trình bàyix
(9) bởi phổ kế khối lượng sẽ được thả với succinimide đầu C- tạo
ra từ asparagine. Trung gian phân cành được xem như là liên quan
một liên kết ester với OH hoặc SH của ser hoặc cys đầu N- của
extein đầu C-, paramyosin (P) trong ví dụ. Báo cáo này tìm thấy
là việc ủ chất trung gian phân cành biến chất guanidine ở pH 9
cho M + IP, chỉ dấu laflieen kết ester không bền kiềm nhiều hơn
đến từ extein đầu amino đến extein đầu C-, đúng ra là từ intein.
Cơ chế khá được chấp
nhận hiện nay trong việc nốix (10), xi
(11), được trình bày trong Hình 2 của tài liệu phát. Điều này
liên quan (i) sự tấn công ưa nước của intein ser hoặc cys trên
carboxyl đầu C- của extein đầu amino, một N-S hoặc N-O xê dịch
sao cho nó có thể được thấy trong việc tạo ra nhóm
-keto
trên histidine decarboxylase, và khi được quan sát với peptide
thường trong điều kiện chua; (ii) sự dịch este-hoá xuống cuối
nguồn ser hoặc cys, tạo ra chất trung gian phân cành; (iii) sự
tấn công của NH2 của asparagine đầu G- của intein
trên carboxyl này, cho succinimide đầu C- của intein, (iv) O
(hoặc S) đến dịch N của carboxyl trở lại nhóm amino của extein
cuối nguồn. Dịch O-N này phải là nhanh, vì sản phẩm MP ổn định
kiềm. Histidine gần asparagine hình như sẽ có liên quan ở giai
đoan iii nhưng không ở i hoặc ii, vì khi được thay thế bởi những
aminoacids khác chất trung gian phân cành được tạo ra những việc
nối không thực hiện. Cơ chế còn được khảo sát về VMA intein của
ATPase khổng của Saccharomyces cerevisiaexii
(12). Gọi tắt là Sce VMA intein.
Từ khi Xu và Perler
làm việc ở một công ty, họ đã phát triển một sản phẩm, một hệ
thống tinh chế protein giống như hệ thống với một chất
glutathione-S-transferase có thể chia hoặc protein liên kết
maltose nhưng không đòi hỏi enzym phân giải protein, nó dùng
intein trong việc chia cắt, nhưng không nối chuỗi đầu C- trở
lại. Protein được vô tính trên một vectơ với đầu C- của nó gần
cysteine đầu amino của Sce VMA intein, với một miền liên kết
chitin ngoài intein. Protein hoà được tạo ra trên E. coli
và hấp thụ trên cột chitin. Cột sau đó được ủ qua đêm ở 4o với
dithiothreitol hoặc
-mercaptoethanol,
giữ vai trò của Cys455, đầu N- của extein thứ hai- nó
thay intein cysteine bởi dich-este-hoá. Protein sau đó được thả,
với dithiothreitol trong liên kết thioester với đầi C-. Có thể
chia cắt dễ chất này với hydroxylamine, hoặc thay nó với [14C]-cysteine
ccó thể dịch-este-hoá và sau đó tiến hành chuyển dịch để tạo ra
một liên kết peptide, vì thế nhãn protein một cách ổn định.
Vài phản ứng liên
quan được trình bày bởi Sao và Kent. Protein tiền tố "hàng rào
âm thanh"- một tên phát sinh từ tưởng tượng của những nhà di
truyền học Drosophila- quan trọng trong việc tạo
mô hình cấu trúc phôi, tự chia thành hai proteins ở chất tồn lưu
cysteine. Trong trường hợp này dịch-ester-hoá kế tiếp không phải
là một cysteine khác, nhưng với hydroxyl của một cholesterol,
tạo ra một protein kỵ nước nhiều hơnxiii (13). Vì thế
những nhà sinh học phân tử cần biết hoá học protein.
Còn lai để kết tinh
thể việc chia cắt protein tiền tố để đặt những amino acids khác
nhau trong không gian và xác định có hoặc không chỉ những amino
acids lân cận là cần trong việc xúc tác phản ứng, hoặc những
phản ứng khác xa nhiều hơn trong không gian cũng tác động. Nếu
có, chúng có thể chỉ ở trong intein, vì thế có nghĩa là tất cả
là cần, và ngoại hình thường xuyên của phản ứng tự chia cắt để
lại một serine đầu amino, threonine hoặc cysteine gợi ý là ít
nhất chuyển dịch N-O hoặc N-S không đòi hỏi cấu trúc bất thường.
Một sửa sai mới của
một amino acid trên một protein là đảo đoạn của một L-amino acid
đến một D-amino acidxiv (14), xv (15).
Nhện mạng phễu Agelenopsis aperta tạo ra một nọc
độc có toxins peptide làm tê liệt con mồi của nó bằng cách ngăn
chặn kênh Ca++ nhạy điện thế. Toxins được tổng hợp khi những
chất tiền tố lớn hơn cũng có những chuỗi tín hiệu trong việc vận
chuyển ngoại bào và chuỗi acidic chia cắt hết để tạo ra toxins
trưởng thành. Hai trong những toxins này, IVB và IBC, có những
chuỗi đồng nhất 48 a.a dài và cùng những liên kết đồng nhất,
nhưng có thể tách riêng trên hplc. IVB có độc tính nhiều hơn rất
nhiều. Việc chia cắt protease ở Glu42 hoặc chia cắt
CNBr tử Met43 cho hexa- hoặc polypeotides đầu C- từ
hai toxins có thể tách riêng bởi hplc, trong khi peptides từ
phần còn lại của toxin không thể phân biệt. Peptides với chuỗi
đầu C-, Gly-Leu-Ser-Phe-Ala, được tổng hợp với có hoặc không L-
hoặc D-ser ở vị trí 46 (hắn là chúng cố gắng những D-amino acids
khác nữa, nhưng báo cáo cấu trúc chưa được công bố) và cùng tách
rửa với peptides của toxins, leptide L-ser có chất của IVC,
peptide D-ser có chất của IVB hoạt động nhiều hơn. Sau đó chúng
tổng hợp toxins hoàn toàn có L- hoặc D-ser ở vị trí 46, và cho
biết là chất gì xếp đúng giống nhau so với chất toxin tự nhiên.
Nọc độc thô qui đổi
IVC thành IVB, điều này được minh chứng tốt nhiều hơn khi nọc độ
bị chia bởi lọc gel, tách riêng isomerase 30 kDa khỏi một
metalloprotease 86 kDA trái lại làm xuống cấp IVC. Điều này chỉ
rõ một lý do vè đảo đoạn trên. Những liên kết peptide D-amino
acid không được chia cắt bởi proteases chia cắt những liên kết
peptide L-amino acid tự nhiên, con mồi côn trùng có thể dùng để
khử độc tố IVC. Nhưng quan trọng nhiều hơn, đảo đoạn cho phép
độc tố sẽ thích hợp nhiều hơn với những kênh Ca++ nó ngăn cản,
làm cho nó một độc tố mạnh nhiều hơn, kho chứa thể cấu tạo
protein được thêm vào. Tôi có thể cho các bạn nhiều ví dụ tương
tự nhưng peptides nhỏ nhiều hơn với D-amino acids, nhưng chúng
được trình bày trong báo cáo của Kreil tôi sẽ gửi đến các bạn
Liên kết với điều
tôi vừa nói về liên kết peptide D-amino acid đang ổn định với
proteases, tôi trình bày là những công ty dược phẩm quan tâm
nhiều hơn đến peptides hoạt động về mặt sinh học với có hoặc
không D-amino acids hoặc nitrogen methyl-hoá trên liên kết
peptide, vì những điều này sẽ là kháng lại sự chia cắt phân giải
protein để cho viên thuốc có thể uống được, pepdide sẽ không bị
nghiền trong dạ dày.
Biến đổi sau dịch
mã
Việc thả 1 chuỗi
palypeptide hoàn tất từ 1 ribosome thường không phải là bước hóa
học cuối cùng trong việc hình thành 1 protein. Biến đổi lưỡng
trị khác nhau thường xảy ra, trong hoặc sau khi tập hợp chuỗi
polypeptide. Nhiều protein tiến hành biến đổi đồng thời hoặc sau
dịch mã. Tri thức về những biến đổi này cực kì là quan trọng vì
chúng có thể làm thay đổi những đặc tính vật lý và hóa học, xếp,
phân bố cấu hình, tính ổn định, hoạt động, và kết quả, chức năng
của protein. Hơn nữa sự biến đổi tự nó có thể hành động như 1
nhóm chức năng phụ. Những ví dụ về hiệu ứng sinh học biến đổi
protein gồm có phosphoryl-hóa trong dẫn truyền tín hiệu, thích
nghi hóa trong phân giải protein, liên kết axit béo trong khi bỏ
neo màng và tập hợp, glycosyl-hóa trong phản ứng tuyên hổ nửa
cuộc sống protein, xác định mục tiêu, tế bào- tế bào và tế
bào-thể gốc. Về mặt hệ quả phân tích protein và biến đổi sau
dịch mã của chúng là quan trọng đặc biệt trong việc nghiên cứu
bệnh tim, bệnh ung thư, bệnh thần kinh và bệnh tiểu đường.
Glycosyl-hóa
Glycosyl-hóa protein
nhận biết như là 1 trong những biến đổi sau dịch mã chính với
những hiệu ứng có ý nghĩa trong việc xếp protein, phân bố cấu
hình, tính ổn định và hoạt động. Carbohydrates dưới hình thức
oligosaccharides liên kết aspargine (N-liên kết) hoặc
serine/threonine (O-liên kết ) là những thành phần cấu trúc
chính của nhiều protein bề mặt tế bào và bài tiết.
Tính chất phức tạp
của glycosyl-hóa trình bày những vấn đề phân tích proteomic.
Việc đục lỗ giản đơn hóa phân tích glycoprotein bằng cách dùng
O-GlcNAc Western Blot Detection Kit, GelCode Glycoprotein
Staining Kit và Glycoprote in Carbohydrate Estimation Kit.
O-GlcNAc Western
Blot Detection Kit
ß-O-Linked
N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) là 1 hình thức nhận diện mới của
glycosyl-hóa nội bào độc nhất với protein tiếp xúc với những
ngăn hạch và tế bào chất. Không giống như glycosyl-hóa protein O
cổ điển hoặc liên kết N, biến đổi O-GlcNAc chỉ liên quan 1 nửa
GlcNAc đơn liên kết với nhóm hyđroxyl của chất tồn lưu Ser/Thr.
Chứng cứ tăng lên gợi ý là biến đổi O-GlcNAc là 1 biến đổi điều
hòa giống như phosphoryl-hóa, vì điều này có động thái cao với
việc quay vòng nhanh phản ứng lại những tính hiệu tế bào hoặc
những giai đoạn tế bào.
O-GlcNAc Western
Blot Detection Kit (Product # 24565 ) mới được tạo ra trong việc
khám phá đặc biệt protein biến đổi O-GlcNAc. Bộ dụng cụ gồm có
kháng thể vô tính đơn đặc biệt cao nhất trên chuột có thể sử
dụng và chỉ phản ứng với gien liên kết ß-O hoặc biến đổi
threonine GlcNAc. Không có tái hoạt động tréo với liên kết
a-O-GLcNAC, biến đổi , a/ß-O-GalNAc hoặc oligosaccharides liên
kết N khác.
GelCode Glycoprotein
Staining Kit
The GelCode
Glycoprotein Staining Kit (Product # 24562) khám phá những nửa
đường glycoprotein trên gel polyacrylamide và trên màng tế bào
nitơ. Khi xử lý với thuốc thử oxyt hóa được oxyt hóa (chua định
kỳ), glycols hiện diện trên glycoproteins được oxyt hóa thành
aldehydes. Sau khi hoàn tất qui trình, glycols bị nhuộm, cho
những băng magenta có nền màu hồng nhạt hoặc không màu.
Glycoprotein
Carbohydrate Estimation Kit
Glycoprotein
Carbohydrate Estimation Kit (Sản phẩm # 23260) là một phương
pháp giản đơn, nhanh trong việc khám phá glycoprotein và trong
việc ước lượng hàm lượng carbohydrate trên glycoproteins,
Glycoprotein trước hết được oxxyt hóa với sodium metaperiodate
và aldehyde đã hình thành được khám phá bằng cách dùng thuốc thử
sở hữu. Việc khám phá đưa đến một màu tím có một tỷ lệ hấp thụ
với phần trăm thành phần carbohydrate trên glycoproteins.
Phosphoryl-hóa
Việc phosphoryl-hóa
protein qua lại, chủ yếu trên những chất tồn lưu serine,
threonine hoặc tyrosine, là một trong những biến đổi sau dịch mã
nghiên cứu kỹ và quan trọng nhất. Phosphoryl-hóa giữ vai trò tới
hạn trong việc điều hòa nhiều quá trình tế bào gồm có chu kỳ tế
bào, phát triển, apoptosis (bệnh đột ngất?) và dường dẫn truyền
tải tín hiệu. Để hiểu rõ cơ sở phân tử của nhưng cơ chế điều hòa
này, điều cần là nhận diện và mô tả đặc tính những điểm
phosphoryl-hóa này trên proteins. Việc đục lỗ cho vài sản phẩm
gồm có GelCode Phosphoprotein Stain Kit, Phosphopeptide
Isolation Kit và PhosphoProbe-HRP trong việc khám phá và khảo
nghiệm proteins phosphoryl-hóa.
GelCode
Phosphoprotein Stain Kit
GelCode
Phosphoprotein Stain Kit (Sản phẩm # 24550) được tạo ra cho việc
nhuộm đặc biệt proteins phosphoryl-hóa trực tiếp trên jel.
Phương pháp lệ thuộc vào sự thủy phân liên kết protein
phosphoester bằng cách dùng 0,5 N NAOH với sự hiện diện của ions
canxi. Sử dụng bộ công cụ này làm dễ dàng khám phá phosphoserine
và phosphothreonine nhưng không phosphotyrosine. Jel có calcium
phosphate không hòa tan mới tạo ra sau đó được xử lý với
ammonium molybdate trong nitric acid lỏng. Chất phức
nitrophospho-molybdate không hòa tan kết quả cuối cùng được
nhuộm với một dung dịch nhuộm cơ bản có xanh methyl.
Phosphopeptide
Isolation Kit
Phosphopeptide
Isolation Kit (Sản phẩm # 89853) được tạo ra để giản đơn hóa
việc phân lập và nhận diện phosphopeptide với protein tiêu hóa
thông qua phản ứng tương hỗ chuyên tính của nhóm phosphate với
gallium bất động. Phosphopeptide tinh chế có thể được phân tích
bởi phương pháp cổ điển (ví dụ nhãn 32P, sắc ký lớp
mỏng/áp suất cao sắc ký lỏng và thoái hóa Edman) và số lượng vật
liệu cao và phổ kế sắc ký khối lượng lỏng mạnh nhiều hơn (LC-MS)
và phân tích phổ kế khối lượng khử hấp thu/ion-hóa hỗ trợ bởi
chất gốc (MALDI-MS). Phosphopeptides có thể được tách rửa bằng
cách dùng điều kiện kiềm như là 0,1 N ammonium bicarbonate (pH
9), cho phép phân tích trực tiếp bởi phổ kế không dùng mẫu vật
phụ.
PhosphoProbe-HRP
PhosphoProbe-HRP và
Bộ công cụ (Sản phẩm # 15166, 15167) dùng một chất dẫn xuất hoạt
hóa bởi Sắt (Fe3+) của horseradish peroxidase (HRP) có thể được
dùng để khám phá phân tử phosphoryl-hóa. Sắt tam (Fe3+) phản ứng
tương hỗ với ái lực cao với nhóm phospho (Ka >101 3/M) và, vì
thế, có thể dùng để khám phá phosphoproteins, phosphopeptides,
organophosphates và những phân tử phosphoryl-hóa. Sản phẩm này
có thể được dùng trong những ứng dụng ELISA,
immunohistochemistry (hóa học mô miễn dịch) và thấm Western,
Phosphoprotein Phosphate Estimation Assay Kit
Phosphoprotein Phosphate Estimation Assay Kit (Sản phẩm # 23270) là phương
pháp nhanh và dễ sử dụng trong việc xác định phạm vi
phosphoryl-hóa một protein tinh chế. Khảo nghiệm được dựa trên
thủy phân kiềm phosphate khỏi chất tồn lưu seryl và threonyl
trên phosphoproteins và xác định số lượng của phosphate thả bằng
cách dùng xanh malachite và ammonium molybdate. Phương pháp này
có thể nhận diện nột protein không biết đang quan tâm như một
phosphoprotein có phosphoserine hoặc phosphothreonine và phạm vi
phosphoryl-hóa. Mẫu protein tinh chế được so với một bộ tiêu
chuẩn liều lượng đặc biệt của phosvitin, một phosphoprotein của
chừng mực phosphoryl-hóa đã biết. Tuy nhiên, phương pháp này
không thả phosphate khỏi chất tồn lưu phosphotyrosine.
RGC
ngày 27-11-2005
Common
Postranslational Modifications
Sulphydryls
(C)
Disulphide bond -2.0159 Oxidation
+15.9994
Cysteinylation +119.1442 Glutathionylation
+305.3117
Amines
(K/N-terminus)
Methylation +14.0269 Formylation
+28.0104
Acetylation +42.0373 Lipoic acid
+188.3147
Farnesylation +204.3556 Myristoylation
+210.3598
Biotinylation +226.2994 Palmitoylation
+238.4136
Stearoylation +266.4674 Geranylgeranylation
+272.4741
Acids & amides
(E/D/Q/N)
Pyroglutamic
acid
(Q) -17.0306 Deamidation (Q/N)
+0.9847
Carboxylation
(E/D)
+44.0098
Hydroxyl groups
(S/T/Y)
Phosphorylation +79.9799
Sulphation +80.0642
Carbohydrates
(S/T/N)
Pentoses +132.1161
Deoxyhexoses +146.1430
Hexosamines +161.1577
Hexoses +162.1424
N-acetylhexosamines +203.1950 Sialic
acid +291.2579
--------------------------------------------------------------------------------
If you don't see
your modification here, try the modifications list from the
University of Melbourne, Delta mass 2.0.
Trở về Trang Chính
| 