Nấm đạo ôn lúa Magnaporthe grisea là một mầm bệnh thực vật tàn phá cao và một trong những quan trọng nhất khảo nghiệm về những mặt đa dạng của tương tác ký chủ -thực vật. Điều này đã được chấp nhận rộng rãi như là một sinh vật kiểu mẫu vì nó thích hợp một cách lý tưởng với việc khảo nghiệm di truyền và sinh học. Để tạo thuận lợi việc khảo nghiệm vô tính trên nền bản đồ, đường đi nhiễm thể, và tổ chức bộ genome của M. grisea, một bản đồ vật lý hoàn toàn của nhiễm thể 7 được xây dựng sử dụng một thư viện (BAC) nhiễm thể nhân tạo vi sinh đoạn chèn lớn (130kb). Việc sử dụng 147 vô tính sao đơn đặc hiệu nhiễm thể 7 và 20 dấu RFLP trên nhiễm thể 7, 625 vô tính BAC được nhận diện bằng phương pháp lai tạo. Những vô tính BAC được tiêu với HindIII, và đoạn được tách riêng theo kích thước trên jel aga phân tích để tạo ra DNA fingerprints. Những vùng tiếp cận lai tạo được xây dựng sử dụng một thuật toán chi phí ngẫu nhiên, nhưng trái lại vùng tiếp cận fingerprintings được xây dựng sử dụng gói đĩa mềm FPC. Kết quả từ cả hai phương pháp thường là phù hợp, nhưng nhiều bất thường được khảo nghiệm. Dữ liệu kết hợp tạo ra năm vùng tiếp cận (contigs) có neo mạnh sau khi khép kín khoảng trống bởi đường đi nhiễm thể. Những bản đồ di truyền và vật lý phù hợp chặt với nhau. Bản đồ vật lý cuối được ước tính che phủ >95% của 4, 2 Mb của nhiễm thể 7. Dựa trên bản đồ những vùng tiếp cận, một BAC tile nhỏ nhất có 42 vô tính BAC được tạo ra, và tổ chức của yêú tố sao và gen thể hiện của nhiễm thể được khảo sát.

Phần dẫn nhập:

Cây lúa (Oryza sativa) là lương thực chủ yếu của một nửa dân số trên thế giới. Vì vậy, bệnh trên cây lúa là mối quan tâm đặc biệt. Nấm đạo ôn lúa Magnaporthe grisea là một trong những bệnh lúa tàn phá nhất ở bất kỳ nơi nào ngũ cốc này được trồng (Ou, 1985). Tất cả những phần trên không của cây trồng có thể bị lây lan; tuy nhiên, thiệt hại năng suất nghiêm trọng nhất khi nấm lây lan và tiêu diệt thân dưới bông đang phát triển (bông lúa). Theo định kỳ, bệnh chịu trách nhiệm về tình trạng thiếu nghiêm trọng lương thực trong vùng, tạo ra đau khổ rất lớn cho con người.

Nấm là một thể đơn bội, dị tản. Bào tử nang (Rossman et al 1990) và những nòi hữu thụ cao trong phòng thí nghiệm đã được phát triển (Valen et al 1986; Kolmer và Ellingboe 1988; Chao và Ellingboe 1991). Điều này có một kích cỡ bộ genome tương đối nhỏ thay đổi từ 40 Mb đến 50 Mb, cho phép dễ tách riêng phần lớn tất cả những nhiễm thể 7 của nó bởi hiện tượng xung điện di   (pulse-field electropheresis) (Romao và Hamer 1992; Skinner et al 1993; Sweigard et al 1993). Một vài phòng thí nghiệm đã có liên quan trong việc tạo ra một bản đồ liên kết tổng hợp, có dư lượng 200 dấu (Nitta et al 1997). Bộ genome có một vài lớp DNA sao, gồm có LINE, SINE, và những yếu tố retrotransposon (Romao và Hamer 1992; Nitta et al 1997). Nấm đạo ôn lúa dễ sử dụng cho di truyền và di truyền phân tử. Những đặc tính này đã tạo cơ hội để khảo nghiệm rộng rãi chuyến tính hóa ký chủ và giống trồng, nghiên cứu sâu những cơ chế điều hòa sự hình thành của những tế bào lây lan chuyên hóa, những giác bám, và những mặt khác của quá trình sinh bệnh. Phối hợp với khả năng  sử dụng cây lúa, phương pháp này đã trở thành một trong những mô hình quan trọng nhất để khảo nghiệm phản ứng tương hỗ ký chủ -mầm bệnh (Valent và Chumley 1991; Dean 1997; Zhu et al 1997). Đến nay, một vài gien điều khiển quá trình lây lan, đường dẫn truyền tải tín hiệu, và nhận biết cây trồng ký chủ đã được nhận diện; tuy nhiên, đa số lớn gen quan trọng vẫn sẽ được phát hiện (Talbot et al 1993; Kang et al 1994; Mitchell và Dean 1995; Sweigard et al 1995; Xu và Hamer 1996; Zhu et al 1996; Choi và Dean 1997; Liu và Dean 1997).

Một mặt quan trọng của bước tiến nhanh thường xuyên trong giải phẫu ở mức phân tử nấm đạo ôn lúa là tạo ra một bản đồ vật lý dễ hiểu. Một bản đồ vật lý hoàn toàn sẽ tạo thuận lợi nhiều cho cho việc vô tính gien bởi những phương pháp khác nhau, như là sự bổ sung, đường đi nhiễm thể, việc chọn lọc, hoặc chọn lọc di truyền âm tính (negative genetic selection) có một tỷ lệ thành công gia tăng ít nhất gấp lên ba lần (Balding và Torney 1997; Prade et al 1997). Việc nén một bản đồ vật lý rườm rà đến một bộ tối thiểu vô tính trùng lắp (đường dẫn đá lát =tile path) có thể cũng tạo ra cơ sở để bỏ neo và lệnh ESTs. Hơn nữa, đường dẫn đá lát tối thiểu sẽ tạo ra phương pháp làm việc để sinh chuỗi toàn bộ genome đạo ôn lúa. Trước kia, một thư viện BAC (=nhiễm thể nhân tạo vi sinh) được xây dựng sử dụng nòi lây lan lúa 70-15 (Zhu et al 1997). Thư viện này tạo ra lớp che phủ sâu (>25 tương đương genome), thích hợp để xây dựng bản đồ vùng tiếp cận và vùng tiếp cận sẵn sàng chuỗi của bộ genome của Magnaporthe grisea.

Để xây dựng những bản đồ vật lý sử dụng đoạn chèn lớn, hai phương pháp thường sử dụng là lai tạo và fingerprinting (Coulson et al  1988; Sulston et al 1988; Wang et al 1994; Marra et al 1997; Talt et al 1997). Mặc dù những phương pháp tiếp cận này đã có giá trị lớn, mỗi có một số thiếu sót tiềm tàng. Những thí dụ về khó khăn không ngờ đa dạng được trình bày trong phần thảo luận về dữ liệu của chúng tôi. ở đây, chúng tôi báo cáo một bản đồ vật lý mạnh của nhiễm thể 7 của M. grisea sử dụng cả hai dữ liệu lai tạo và fingerprinting.

Những số liệu kết hợp tạo ra năm vùng tiếp cận có thả neo che phủ >95% nhiễm thể 4,2-Mb. Những bản đồ di truyền và vật lý có tính cùng đường thẳng (collimear) trên toàn bộ nhiễm thể. Một đường dẫn 'tiling' nhỏ nhất có 42 vô tính BAC được chưng cất từ những bản đồ vật lý và sử dụng để bắt đầu phân tích cấu trúc và tổ chức của nhiễm thể. Những kết quả cho thấy là những yếu tố sao không được phân bố một cách ngẫu nhiên dọc theo nhiễm thể; thay vì, chúng có xu thế được chia nhóm cách xa vùng trung tâm. Mặt khác, sự phân bố gien thể hiện trong suốt cả hai giai đoạn lây lan và sinh dưỡng dường như được phân bố ngẫu nhiên hơn qua toàn bộ nhiễm thể.

Kết quả

Phương pháp xây dựng bản đồ vật lý

Mục tiêu thứ nhất của chúng tôi là để xây dựng lại một bản đồ vùng tiếp cận của nhiễm thể 7 sử dụng vô tính BAC từ thư viện ABC của chúng tôi. Việc sử dụng DNA sao đơn không trùng lắp như những mẫu dò phương pháp lai tạo colony blot có thể cho phép nhận diện những vô tính chuyên tính vùng và bắc cầu để kéo gần nhau những khoảng trống giữa những mẫu dò, dẫn đến việc xây dựng vùng tiếp cận lai tạo (hybridization contigs). Do đó hai vô tính BAC không trùng lắp trong một vùng nhiễm thể sao đơn có thể liên kết vật lý bằng vô tính bắc cầu phổ biến. Tuy nhiên, trong những vùng đông quần thể có DNA sao, khó nhận diện DNA sao đơn như là mẫu dò lai, và như trên, việc nhận dạng vô tính BAC bắc cầu để hàn gắn những khoảng trống bị giới hạn. Với một chừng mực lớn, phương pháp DNA fingerprinting của BAC có thể khắc phục bài toán này vì tập hợp vùng tiếp cận dựa trên đoạn gen ức chế cắt chia xẻ của vô tính BAC.

Do đó, phương pháp tạo ra gồm có lai tạo với vô tính BAC chuyên tính nhiễm thể 7 có DNA sao đơn, lai tạo với 20 markers RFLP trên nhiễm thể 7, fingerprinting của tất cảvô tính BAC chuyên tính nhiễm thể 7 được nhận diện bởi lai tạo, và tập hợp vùng tiếp cận dựa trên cả hai phân tích lai tạo và fingerpringting.

Việc nhận diện của vô tính BAC chuyên tính nhiễm thể 7

Vì những yếu tố sao có thể tạo ra những bài toán có ý nghĩa trong tập hợp vùng tiếp cận sử dụng dữ liệu lai tạo colony blot, một thư viện con sao đơn là cần. Để nhận diện vô tính BAC có DNA sao đơn, DNA genome tổng số của nòi 70-15 được nhãn và sử dụng như một mẫu dò để lai với thư viện ngăn nắp. Một nửa thư viện BAC, tương đương với -12 x genome che phủ, được sử dụng. Dựa trên cường độ lai, 47% (2137 vô tính BAC) của vô tính được xem là có DNA "sao -đơn" và sắp xếp lại trên những bộ lọc mới.

Những nhiễm thể nguyên vẹn được tách riêng sử dụng một hệ thống jel CHEF theo sau là sự thu hồi DNA của nhiễm thể 7 và DNA của 6 nhiễm thể còn lại. Những mẫu dò DNA nhãn 32P từ nhiễm thể 7 và nhiễm thể còn lại tập hợp được lai theo chuỗi với bộ lọc DNA sao đơn (số liệu không trình bày). Vì những nhiễm thể 7 và 6 di trú gần trên jel CHEF, DNA từ nhiễm thể 6 cũng được sư ỷdụng như một mẫu dò để lai với cùng những bộ lọc. Bằng so sánh ba bộ dữ liệu lai khác nhau, 147 vô tính BAC có DNA sao đơn được xác định sẽ là chuyên tính nhiễm thể 7. Để xác minh  chuyên tính nhiễm thể 7, mộ vài vô tính được chọn ngẫu nhiên từ tập hợp của 147 và dò những nhiễm thể tách riêng jel CHEF từ M. grisea. Tất cả lại đặc hữu với nhiễm thể 7 (số liệu không trình bày).

Tập hợp vùng tiếp cận sử dụng thuật toán chi phí ngẫu nhiên

Để nhận diện những vô tính BAC chuyên tính nhiễm thể 7 phụ, một phương pháp lai không thay thế được sử dụng (Prade et al 1997). Trong vòng lai thứ nhất, 6 vô tính BAC ngẫu nhiên được chọn như những mẫu dò từ tập hợp của 147 BACs để lai với thư viện che phủ genome gấp 12 lần. Trong vòng lai thứ hai, 6 vô tính BACs ngẫu nhiên khác được chọn từ những vô tính chưa nhận diện bởi 6 mẫu dò BAC trước trong một tập hợp sao đơn. Phương pháp này được lập lại cho đến khi tất cả những dòng vô tính trong tập hợp 147 BACs hoặc là được sử dụng như những mẫu dò hoặc nhận diện bởi những mẫu dò BAC khác. Điều này dẫn đến 55 khảo nghiệm lai nhận diện 585 vô tính BAC. Để hoàn tất độ che phủ tối đa, cả hai đầu của 55 vô tính BAC đã sử dụng được nhãn và phối hợp trong cùng khảo nghiệm lai. Trung bình, mỗi mẫu dò BAC đã nhận diện 24 khuẩn lạc mỗi khảo nghiệm lai, phù hợp độ che phủ 12 lần trong thư viện..Tất cả những dấu RFLP của nhiễm thể 7 (Nitta et al 1997) trừ ra hai dấu xa tâm được sử dụng để nhận diện vô tính BAC phụ trên nhiễm thể 7. 19 trong 20 dấu RFLP đã nhận diện 305 vô tính BAC với một trung bình 16 mỗi mẫu dò; tuy nhiên, dấu CH5 -58H không lai với bất kỳ vô tính BAC cả sau ba lần lai khuẩn lạc có lặp lại với bộ lọc thư viện có độ che phủ 12-lần. Mẫu dò này lai mạnh với gien HindIII trên một genomic Southern blot của nòi 70-15. Khi CH5-58H được sử dụng để lai toàn bộ thư viện BAC (độ che phủ 24-lần), một vô tính BAC lai dương tính 15C20 được nhận diện. Mười lăm trong 20 dấu RFLP không nhận diện vô tính BAC mới trong thư viện độ che phủ genome 12-lần khác so với vô tính BAC 585 được nhận diện trước kia. Năm dấu khác đã tìm thấy một bổ sung 40 vô tính BAC, do đó dẫn đến một tổng số 625 vô tính BAC chuyên tính nhiễm thể 7. Như là một kết quả của khảo nghiệm lai, một mẫu dò và ma trận dữ liệu nhị phân mẫu dò được tạo ra, trong đó vô tính BAC nhận diện bởi những mẫu dò (xem như là hits) được trình bày trên hàng và mẫu dò trên cột.

Việc sử dụng một thuật toán chi phí ngẫu nhiên để phân tích ma trận nhị phân dẫn đến chín vùng tiếp cận có một kích cỡ trung bình ước tính 467 kb (giả định toàn bộ nhiễm thể che phủ = 4200 kb/9 contigs. Contig lớn nhất có 100 vô tính BAC, nhưng trái lại nhỏ nhất chỉ có 13 vô tính BAC. Sau khi vô tính rườm rà được lấy đi khỏi contigs để xây dựng bản đồ contig nén, khoảng cách vật lý của từng contig được ước tính dựa trên kích cỡ chèn trung bình của vô tính BAC như trình bày trong Hình 1. Giả định độ che phủ 50% giưa hai vô tính BAC kế cận trên bản đồ contig lai nén (Prade et al 1997), tổng số dài vật lý của nhiễm thể 7 được ước tính -4, 7 Mb. Điều này lớn hơn rất nhiều so với dài vật lý ước tính 4, 2 Mb dựa trên phân tích jel CHEF bởi khảo nghiệm này và những khảo nghiệm khác (Skinner et al 1993; Talbot et al 1993; Orbach et al 1996). Chúng tôi đã tìm thấy tiếp theo, như trình bày trong phần nói về xây dựng bản đồ bởi những những phương pháp kết hợp, là hai trong số contigs này che phủ -600 kb phát sinh từ nhiễm thể 6, giải trình về việc ước tính quá mức kích cỡ.

Hình 1. Contigs lai tạo. Tên của những dòng vô tính được trình bày bên lề bản đồ thứ tự liên quan đến contigs. Những con dò được chỉ định theo cột. Số lượng của những khác biệt trong số lượng gọi số giữa vô tính BAC và dòng vô tính BAC tiếp cận kế tiếp (khoảng cách d Hamming cặp đôi, tính toán số lượng khác biệt giữa hai dòng vô tính trong số lượng gọi số của chúng hoặc fingerprints) cũng được trình bày bên lề kế tên dòng vô tính. Đường ngang cách đoạn chỉ dấu biên của contigs. Kích thước tính toán của từng contig được trình bày. Do giới hạn không gian, những dòng vô tính thừa dược lấy đi khỏi contig.

Việc tập hợp nhóm vô tính thành những contigs lớn dựa trên việc nhận diện những vô tính bắc cầu phổ biến nhận diện bởi vô tính dò lân cận. Arratia et al (1991) chỉ ra là hai hay nhiều hơn vô tính bắc cầu phải hỗ trợ một liên kết trên bàn đồ contig lai để tránh những liên kết sai do vấn đề khảo nghiệm, như là chuỗi lặp lại (Wang et al 1994). Ba mươi mốt trong số 81 liên kết (38%) theo dữ liệu của chúng tôi hõ trợ chỉ bởi một vô tính đơn, với những liên kết còn lại hỗ trợ bởi nhiều hơn ba vô tính bắc cầu tính trung bình. Trong những vùng ở đó dấu di truyền được định vị chỉ khoảng một nửa contigs lai có tính cùng đường thẳng với dữ liệu di truyền. Hơn nữa, vô tính BAC nhận diện bởi cùng mẫu dò thường được chỉ định cho những contigs khác nhau. Về điểm này, chúng tôi nghĩ một phương pháp không phụ thuộc để xác minh là cần.

Tập hợp contigs bởi DNA fingerprinting

Để thắp sáng quan hệ vật lý giữa vô tính BAC trong những contigs lại, tất cả 625 vô tính BAC là đôi tượng để hoàn tất tiêu HindIII. Sau khi tiêu BAC được tách riêng trên jel aga phân tích (Phương pháp) tiếp theo nhuộm với SYBR Gold, hình ảnh jel được chụp, để dành như tệp tin TIFF, và chuyển sang trung tâm làm việc UNIX. Vì 48 mẫu được chạy trên một jel đơn có dấu DNA ở mỗi luồng thứ 5 (nghĩa là hình 5), 13 tệp tin jel được tạo ra. Băng ức chế cắt được gọi sử dụng phần mềm Image (Phương pháp). Những băng <1 kb được bỏ qua vì chúng khá phân tán và chiếm <1% dài tổng cộng của chèn BAC. Tập tin băng kết quả, có tính di động tương đối của tất cả gien ức chế cắt phát sinh từ 625 vô tính BAC, sau đó biến đổi thành khổ sử dụng với phần mềm FPC.

Hình 2. Một hình ảnh của jel aga phân tích của BAC DNA fingerpringting. Jel được nhuộm với vàng SYBR và hình ảnh đã nhận. Khối lượng phân tử của băng đường đánh dấu (kb) trình bày trong mỗi đường thứ năm, từ phía trênm là 32,7; 23,1; 19,0; 15,3; 12,5; 10,0; 9,4; 8,0; 7,0; 6,6; 6,0; 4,4; 4,0; 3,0; 2,3; 2,0; 1,6; 1,4; và 1,0.

Tập hợp contig có lặp lại ở những giá trị cắt khác nhau có giá trị chịu không thay đổi là 7. ở một giá trị cắt 10-9. 22 contigs FPC có ít nhất sáu vô tính BAC và 30 contigs có ít hơn sáu vô tính BAC nhận. Một trăm mười một vô tính BAC không được chỉ định cho contigs. Khi giá trị cắt khó khăn 10-10 được sử dụng, contig 1 chia ra thành hai contigs riêng biệt. Mặt khác, ba contigs riêng biệt ở một vị trí cắt 10-9 kết hợp ở một giá trị cắt 10-8. Vì thuật toán so sánh vô tính kết hợp với tính chịu có những tham số cắt và số băng phù hợp với số băng trên mỗi vô tính, chúng tôi đã tinh chế cho đến khi thuật toán tạo ra những kết quả phù hợp với khảo sát bằng mắt của fingerprints. ở một vị trí cắt 10-8, contig lớn nhất có 384 vô tính BAC, nhưng trái lại ở một vị trí cắt 10-9, contig lớn nhất chỉ có 90 vô tính BAC. Chúng tôi đã xác định là không thực tiễn để phân tích bằng mắt một contig có >100 vô tính, nên giá trị cắt 10-9 được chọn như chuẩn mức của chúng tôi. Thứ tự của vô tính BAC trong từng vùng contig được tính chế riêng sử dụng thuật toán băng liên ứng (consensus) (CB)(Soderlund et al 1997). Những thứ tự mới sau đó được khảo sát băng mắt những fingerprints của BACs. Thay đổi cuối được thực hiện bằng tay để chỉnh bất kỳ sai số nhỏ, Những kết quả cho thấy là 5 trong số 20 dấu RFLP được chỉ định cho 5 contigs riêng biệt, nhưng trái lại số dấu còn lại được chỉ định cho những nhóm hai hay nhiều hơn contigs còn lại.

Mặc dù FPC tạo ra tập hợp contig thỏa đáng, những kết quả cho thấy một số dạng bất thường. ở một giá trị cắt 10-9, 111 vô tính BAC không được chỉ định cho bất kỳ contigs (singletons=đơn tử). Trong một vài trường hợp thứ tự của vô tính BAC trong một contig có thể không được xác định rõ vì hơn một thứ tự có thể đối với tập hợp contig được suy diễn. Điều này phần lớn là do những mâu thuẫn trong cách gọi băng hoặc tiêu từng phần. Chỉ 4% BAC fingerprints được xem là không thể chấm điểm. Những contigs FPC thường có tính cùng đường thẳng với dữ liệu di truyền trừ một trường hợp biệt lệ. Những dấu RFLPCH3 -85H và A14C9 được chỉ định cả hai cho FPC contig 1 ở một điểm cắt 10-9, mặc dù contig này chia ra ở giá trị cắt thấp (xem bên dưới). Ngoài ra, những vô tính BAC lai với cùng mẫu dò BAC thỉnh thoảng không được chỉ định cho một contig FPC và để lại như đơn tử (singletons).

Xây dựng bản đồ vật lý bởi những phương pháp kết hợp và đóng khoảng trống

Vì những kết quả chỉ rõ là tập hợp contig sử dụng hoặc là dữ liệu lai hoặc dữ liệu fingerprinting riêng thể hiện khiếm khuyết có ý nghĩa, hai phương pháp tiếp cận được phối hợp. Khi những danh sách của vô tính BAC nhận diện bởi cả hai mẫu dò BAC và RFLP được khảo sát về việc chỉ định contig bởi lai và FPC, điều đã được tìm ra là 31 trong 55 mẫu dò BAC phát sinh từ những contigs khỏe. Một contig FPC được xác định là khỏe nếu nó bao gồm phần lớn dòng vô tính BAC nhận diện bởi ít nhất một con dò lai tạo riêng biệt. Những dấu RFLP ở trong vùng contig khoẻ trừ dấu RFLP CH5-58H, chỉ được nhận diện một dòng vô tính BAC. 24 con dò còn lại nhận diện những dòng vô tính được chỉ định cho ba hoặc nhiều hơn contigs FPC. Những con dò ấy và những dòng vô tính tương ứng nhận diện bằng cách lai tạo (264 dòng vô tính) bị loại khỏi phân tích tiếp theo. 360 dòng vô tính BAC còn lại được chỉ định cho 13 vùng contigs, 9 trong đó bị neo lại bởi 19 dấu di truyền (Hình 3). Tám trong 9 contigs bị neo lại phù hợp chặt chẽ với contigs lai tạo. Tuy nhiên, những dấu di truyền CH3-85H và A14C9 đều nằm trong contig FPC 1 ở điểm cắt 10^-9, mặc dù điều này không được ủng hộ bởi bản đồ di truyền hoặc những kết quả lai tạo. Khi giá trị cắt bị giảm xuống 10^-10 (nghĩa là một điều kiện nghiêm ngặt nhiều hơn), dùng thuật toán CB trong việc tinh chế lại vùng contig, một sự tạo ra kết quả rời những vùng contigs 1A và 1B được dự kiến trước. Vì thế, điều tin tưởng hợp lý là một liên kết sai xuất hiện trong vùng contig FPC 1. Vì contig 1 là contig đầu tiên và lớn nhất tập hợp bởi FPC, chương trình có thể không chỉ định những dòng vô tính BAC vào các vùng contigs một cách chính xác. Như đề nghị bởi Soderfund (Soderfund et al. 1997*), chạy thuật toán CB trên những contigs FPC cá thể là điều cần thiết.

Hình 3. So sánh giữa contigs lai tạo và contigs FPC (thanh trắng). Contigs lai tạo (thanh đen) là contigs FPC. Những đường ngang  chỉ dấu những vị trí của dấu di truyền trên nhiễm sắc thể 7 trình bày từ trên xuống dưới, loại trừ TEL13 và TEL14. Những dấu RFLP được nhận diện bởi số lượng (xem Hình 4 về những tên của dấu RFLP- số lượng trình bày trong ngoặc đơn). Lưu ý là contig FPC bị neo bởi những dấu RFLP 14 và 20 rời trong điều kiện phân tích nghiêm ngặt nhiều hơn như chỉ dấu bởi đường đậm nét. Mũi tên chỉ dấu sự hoà lẫn contigs trong điều kiện ít nghiêm ngặt.

Khi giá trị cắt tăng lên đến 10^-8, contig 1A hoà lẫn với contig 6. Hơn nữa, hai trong bốn contigs không neo hoà lẫn với những contigs neo như chỉ dấu bởi mũi tên trong Hình 3. Sau khi nghiên cứu cẩn thận fingerprints của dòng vô tính trong những miền hoà lẫn và những kết quả từ đường đi nhiễm sắc thể, vùng hoà lẫn được chấp nhận. Như trình bày trong Hình 3, mọi vùng contigs neo có nhiều hơn một con dấu RFLP đồng tuyến tính với bản đồ di truyền. Ở điểm này, hai contigs khoẻ không neo, 240 và 380 kb bề dài , còn lại. Để xác định có hoặc không chúng thuộc về nhiễm sắc thể 7, những dòng vô tính BAC chọn một cách nẫu nhiên từ cả hai vùng contigs được lai với nhiễm sắc thể M. grisea tách riêng trên jel CHEF. Những kết quả cho biết là cả hai phải được chỉ định cho nhiễm sắc thể 6 (số liệu không trình bày). Kết quả này không mong đợi vì độ dài của bản đồ vật lý có thể dã vượt quá tính toán trước (Skinner et al. 1993*; Talbot et al. 1993*) kích thước của nhiễm sắc thể 7 bởi 500 kb và đầu gần của nhiễm sắc thể 7 với nhiễm sắc thể 6 được quan sát trên jel CHEF. Việc lấy đi hai contigs này dưa đến chín vùng contigs khoẻ trong nhiễm thể 7 với tám khoảng trống còn lại.

Để đánh dấu những khoảng trống giữa các contigs kế cận nhau, cả hai đầu của dòng BAC ngoài cùng của mỗi contig được nhãn trong việc hướng dẫn đường đi của nhiễm sắc thể đến thư viện BAC hoàn toàn. Những fingerprints của dòng vô tính BAC đã nhận diện là những khoảng trống bắc cầu được đánh giá thêm để xác nhận sự dóng khoảng trống. Điều này đưa đến việc đóng bốn trong tám khoảng trống. Chỉ dòng vô tính BAC 15C20 nhận diện bởi dấu RFLP CH5-58H được liên kết qua hai dòng vô tính BAC với một đầu của contig trong đó dấu RFLP A14C9 được đặt, chỉ dấu là độ che phủ vùn này dưới trung bình xa. Vì sự hiện diện của những yếu tố lập lại trong dòng vô tính cuối, bốn khoảng trống có thể được đong bởi đường đi của nhiễm sắc thể. Bản đồ cuối được trình bày trong Hình 4. Trừ hai dấu đầu xa, chúng tôi vẽ bản đồ vật lý những dấu RFLP 20 cho năm contigs che phủ >95% nhiễm sắc thể. Vì hai contigs nhỏ nhất chỉ có những dấu đơn, những hướng của chúng vẫn không được giải quyết.

Hình 4. Việc xây dựng lại trong ống nghiệm nhiễm thể 7. Sai việc loại trừ 24 con dò và 264 phát hiện, lai tạo và FPC, và dữ liệu di truyền phù hợp rất tốt. Tám contigs bị neo được hoà lẫn bởi đường đi nhiễm sắc thể đến năm contigs (thanh tím), che phủ ~4,1 Mb của nhiễm sắc thể 4,2-Mb. Bản đồ di truyền, trình bày như thanh xanh dương, tiếp giáp giữa phải trên và trái dưới. Sự so sánh khoảng cách di truyền và vật lý cho biết một giá trị trung bình của 41 kb/cM. Những tỷ lệ thay đổi từ 19 đến 180 kb/cM. Sau khi lấy đi những dòng vô tính BAC thừa khỏi mọi vùng contigs, một đường tiling (lát) tối thiểu được tạo ra như chỉ dấu bởi những đường có màu phủ lên nhau ngắn. Tên của mỗi dòng vô tính như được chỉ dấu dưới đây. Khoảng cách giữa mỗi dòng vô tính BAC là ~100 kb với ~30 kb phủ lên nhau. Tỷ lệ màu sắc cho biết bề sâu che phủ của dòng vô tính BAC trong mỗi vùng. Độ che phủ thay đổi từ 1 đến 24 dòng vô tính mỗi 100 kb với một trung bình của 7 dòng vô tính.

Tổ chức của nhiễm sắc thể 7

Để tạo ra sự bổ sung có hiệu quả, đường đi của nhiễm sắc thể, chọn lọc, chọn lọc di truyền âm tính, và những công trình nghiên cứu khác (Balding và Torney 1997; Prade et al. 1997), chúng tôi giảm một bản đồ vật lý nén, hoặc đường dẫn lát tối thiểu của những dòng vô tính BAC từ bản đồ vật lý. Điều này đưa đến việc tạo ra của một lát tối thiểu BAC của nhiễm sắc thể 7 có 42 dòng vô tính BAC, trong đó mỗi dòng vô tính BAC được tách riêng từ dòng kế tiếp bởi ~100 kb với ~30 kb phủ lên nhau (hình 4). Vì thế, bản đồ vật lý cuối của nhiễm sắc thể 7 có 20 dấu RFLP cách khoảng >4,1 Mb (>95% nhiễm sắc thể). Những bản đồ contigs chi tiết có thể xem lại trang nhà của chúng tôi www.genome.clemson.edu. Một so sánh khoảng cách di truyền và vật lý cho biết một giá trị trung bình của 41 kb/cM, rất gần với những kết quả nhwnj được trong những công trình nghiên cứu trước (Skinner et al. 1993; Sưeigard et al. 1993; Nitta et al. 1997). Sự so sánh những bản đồ di truyền và vật lý (Hình 4) cho biết là ở miền gần đầu xa (nghĩa là các dấu G131R và cos209), tỷ lệ giữa khoảng cách vật lý và di truyền chỉ là 19 kb/cM. Điều này nâng cao hoạt động tái tổ hợp được mong đợi ở các miền đầu xa. Ngược lại, tỷ lệ tăng lên đến 180 kb/cM giữa những dấu MAT1-1 và CH3-85H. Như một kết quả xây dựng lát tối thiểu của nhiễm thể 7, bề sâu của độ che phủ của những dòng vô tính BAC cùng với nhiễm sắc thể cũng dược tiết lộ (Hình 4). Độ che phủ thay đổi từ 1 đến 24 dòn vô tính mỗi 100 kb với một trung bình 7 dòng vô tính mỗi 100 kb, chỉ dấu là độ che phủ của dòng vô tính cùng với nhiễm sắc thể 7 ngẫu nhiên rất xa. Hai mươi ba của 42 vùng có một độ che phủ so với trung bình, và mọi khoảng trống được đặt trong những vùng đó. Số lượng tổng cộng của những dòng vô tính BAC trong năm contigs là 289.

Để nghiên cứu sự phân bố của những yếu tố lập lại trên nhiễm sắc thể 7, DNA genomic tổng cộng nhãn ³²P được dùng như con dò tron việc lai tạochongs lại lát tối thiểu BAC tiêu hoá HindIII (Hình 5). Những kết quả cho biết là sự phân bố của DNA sao khôn ngẫu nhiên vì vài miền không có lập lại, nhưng trái lại những miền khác có nhiều DNA lập lại. Để cắt thêm sự phân bố của những yếu tố lập lại cá thể, thấm lát tối thiểu được lai với năm đoạn lập lại có đặc trưng gồm có retrotransposon MAGGY (Farman et al. 1996), transposon lập lại nghịch chuyển Pot2 (Kachroo et al. 1994) và MGR586 (Hamer et al. 1989), yếu tố Mg-SINE (Kachroo et al. 1995) và POR6 (Zhu and Zhu 1993). Để nhận diện những vị trí của gien hiển thị ở những giai đoạn phát triển khác nhau, những con dò  cDNA tạo ra từ những giai đoạn lây lan và sinh dưỡng được dùng trong việc lai tạo với lát BAC tối thiểu. Những số lương đoạn HindIII được lai với những con dò khác nhau được tính toán, và kết quả được tóm tắt trong Hình 6. Như trình bày trong hình 6, vài miền, gồm những vị trí2, 8, 16-18, 20-22, 26, 28, và 40 được tìm thấy không có những yếu tố lập lại. Điều đáng lưu ý là vài yếu tố lập lại có xu thế tập hợp nhóm. Ví dụ, 28 của đoạn 62 HindIII lai với POR6 cũng được nhận diện bởi MAGGY (số liệu không trình bày). Sự phân bố của gien hiển thị dồng nhất một cách tương đối dọc theo nhiễm sắc thể, mặc dù vài miền giàu về những yếu tố lập lại và  gien hiển thị, như là các vị trí 3, 4, 7, 13, và 27. Trong vài miền (các vị trí 2, 8, 17, 26, và 40) trong đó không có DNA lập lại được phát hiện, những số lượng khá cao đoạn HindIII lai với nhữn con dò cDNA từ các giai đoạn lây lan và sinh dưỡng. Năm dòng vô tính BAC 12I18, 11B16, 17B20, 05I23, và 12O01, ở những vị trí 3, 7, 9, 13, và 27 được tìm thấy sẽ là giàu gien hiển thị trong cả hai giai đoạn.

Hình 5. Lát BAC tối thiểu của nhiễm thể 7. Trong lát tối thiểu này, mỗi dòng BAC phủ lên nhau—30 kb với những dòng BAC kế cận xác định bởi tính toán số lượng đoạn HindIII chia sẻ (A) Đặc tính tiêu hoá giới hạn của những dòng vô tính BAC tron lát tối thiểu. (B) Kết quả lai tạo của lát tối thiểu bằng cách sử dụng DNA genomic nhãn tổng số từ nòi 70-15 như một con dò.

Hình 6. Sự phân bố những yếu tố lập lại và gien hiển thị trong những giai đoạn lây lan và sinh dưỡng. Lát tối thiểu BAC tiêu hoá HindIII được lai liên tiếp với những con dò cDNA từ các iai đoạn lây lan và sinh dưỡng và năm yếu tố lập lại đã nhận diện trước. Genomic chỉ dấu DNA genomic tổng số dùng như con dò. Chiều dài của thanh của mỗi dòng vô tính BAC đại diện số lượng đoạn HindIII đan lai với mỗi con dò như trình bày bởi các thanh tỷ lệ. Vị trí cho thấy vị trí vật lý trong các khoảng 100- kb của mỗi dòng vô tính BAC dọc theo nhiễm thể. Tên của các dòng vô tính chỉ dấu bởi vị trí được trình bày trong Hình 4 từ trái qua phải.

Thảo luận:

Chúng tôi đã xây dựng thành công một bản đồ vật lý che phủ >95% của nhiễm thể 7 của M. grisea bằng cách kết hợp hai phương pháp tiếp cận tập hợp vùng contigs riêng biệt, lai tạo và fingerprinting. Vì nhiễm sắc thể 7 là nhiễm sắc thể nhỏ nhất và có thể là dễ dàng một cách tương đối trên jel CHEF, việc xây dựng bản đồ vật lý của nó được phát động như một dự án kiểu mẫu về phía hoàn tất một bản đồ vật lý hoàn toàn của genome hoàn toàn.

Các phương pháp lai tạo và fingerprinting, áp dụng riêng rẽ, trình bày các thiếu sót có ý nghĩa trong tập hợp contig. Trong những khảo nghiệm lai tạo, cường độ của những dòng vô tính BAC được nhận diện bởi một con dò thường thay đổi rất lớn. Biến động được nghĩ sẽ là phần lớn do độ bao trùm giữa con dò và mục tiêu, hoặc thường ít hơn là do  phát triển khuẩn lạc tồi trên các bộ phận lọc. Tuy nhiên, các tín hiệu lai tạo yếu có thể phát sinh từ việc lai tạo dòng vô tính BAC có DNA không đồng nhất, nhưng giống nhau. Hơn nữa, nếu một đoạn trong một con dò được lập lại ở các lô cút khác nhau, điều này có thể cũng điều khiển sai lầm quá trình tập hợp contig. Những khác biệt về cường độ lai tạo và đoạn DNA lập lại có thể không được cung cấp bởi chương trình chi phí ngẫu nhiên. Thay vì phân tích số liệu tuyến tính, thuật toán thường đối mặt với ba- hoặc bốn nhánh điểm trong suốt quá trình tập hợp contig. Do thiếu tính nhạy cảm với cường độ lai tạo, thuật toán đã dùng một qui trình ngẫu nhiên một cách tiềm tàng trong việc tạo ra những vùng contigs sai lầm ở những điểm chia nhánh. Một bằng chứng khác hỗ trợ cho lý lẽ của chúng tôi là việc đánh giá quá mức  dộ dài vật lý của nhiễm sắc thể dựa trên những contigs lai tạo. Như trình bày trong phần Kết quả, hai contigs mạnh dược tìm thấy thuộc về nhiễm sắc thể 6. Một cách thích thú, khoảng cách vật lý  che phủ bởi hai contigs ~600 kb, chừng mực tính toán quá mức  từ những số liệu lai tạo. Vì một  trong những contigs này được chôn vùi trong một trong những contigs lai tạo lớn., điều này có thể gần như không thể thực hiện trong việc nhận biết sai số không có phân tích FPC. Sự hiện diện của những yếu tố lập lại biểu hiện một vấn đề nghiêm trọngtrong tập hợp contig lai tạo; tuy nhiên, chúng tôi đã tìm thấy là chúng không tạo ra những vấn đề rõ ràng trong phân tích FPC. MAGGY phong phú nhất và yếu tố có lập lại lớn nhất nhận diện trên Magnaporthe. Genome của 70-15 có vài trăm sao, năm đa phần tìm thấy trong một dòng vô tính BAC trên nhiễm sắc thể 7. Yếu tố chính nó là ~5 kb và có ba điểm HindIII trong phát sinh những đoạn trong ~900 và ~1000 bp về độ dài và hai đoạn bìa có kích thước thay đổi (Nitta et al. 1997). Những đoạn trong này không được chấm điểm vì chúng dưới điểm cắt của chúng tôi 1 kb và vì thế không liên quan với phân tích FPC. Ngoài ra, trong một dòng vô tính BAC 130-kb, những đoạn HindIII độc nhất viền những yếu tố MAGGY có thể nhận diện một cách dễ dàng bằn lai tạo và có thể cung cấp bản mô tả đặc tính bắc cầu bổ ích trong việc hỗ trợ tập hợp các miền của dòng vô tính BAC giàu những yếu tố lập lại.

Phân tích FPC có những vấn đề riêng của nó, và vài bất thường đã được tìm thấy. Vài dòng vô tính BAC nhận diện bởi cùng một con dò được chỉ định cho những contigs FPC khác nhau hoặc không thể được chỉ định cho bất kể contigs nào (tham khảo như singletons). Ở số điểm cắt 10^~9, 111 dòng vô tính BAC  vẫn là singletons. Điều này đa phần là do sự tiêu hoá một phần hoặc lây nhiễm trong quá trình sử dụn bệnh phẩm. Những contigs khác vẫn là singletons vì chúng không chia sẻ số lượng đủ đoạn gối nhau với những dòng vô tính BAC trong những contigs hiện có sẽ được đưa vào bởi FPC. Vì chúng tôi đang sử dụng một thư viện che phủ 12 x genome, thiệt hại về những singletons này từ phân tích không thể có một ảnh hưởng chính trên tập hợp contigs tổng thể. Điều đã được tìm thấy là gía trị điểm cắt ảnh hưởng một cách có ý nghĩa kích thước của contig lớn nhất. Ví dụ, số lượng dòng vô tính có contig lớn nhất là 384, 90, và 46 ở các vị trí điểm cắt 10^-8, 10^-9, và 10^-10, tương ứng. Số lượng của singletons trình bày một tính nhạy cảm tương tự với các tham số của chương trình. Mặc dù thuật toán CB đã cho phép chúng ta tinh chế thứ tự của các dòng vô tính BAC trong một contig FPC, phản ứng thủ công vẫn là điều cần thiết trong việc phán xét cuối cùng lấy về trong nhiều trường hợp. Không có bất thể thông tin thêm trong việc phán xét chừng mực nghiêm ngặt số liệu phải được xử lý, điều khó là việc tập hợp một bản đồ vật lý có thể tin cậy và hoàn toàn của nhiễm thể 7 bằng cách sử dụng số liệu dấu tay riêng.

Bằn cách kết hợp những kết quả từ cả hai phương pháp tiếp cận, chúng tôi có thể nhanh chóng nhận diện những thiếu sót và loại trừ thành công chúng. Ngoài ra, chúng tôi hỗ trợ rất nhiều trong quá trình tập hợp contig bởi sự hiện hữu của một bản đồ liên kết dầy (Nitta et al. 1997). Trong quá trình lai tạo và phân tích FPC, 24 con dò được tìm thấy tạo ra đa phần bất thường, tuy nhiên, mọi dấu RFLP trừ 1 phát sinh những contigs khoẻ. 24 con dò này có thể có những yếu tố lập lại làm cho nó thành cần loại trừ mọi dòng vô tính nhận diện bởi những con dò này từ việc phân tích thêm. Mặc dù tính toán này còn lấy đi những dòng vô tính thuộc về nhiễm sắc thể 7, chúng tôi không thể dễ dàng nhận diện dòn vô tính nào là hợp pháp và dòng vô tính nào thì không.

Chúng tôi còn học tập một bài học có giá trị trong quá trình vẽ bản đồ vật lý. Khi dấu RFLP 21-3-E lần đầu tiên được dùng trong việc nhận diện những dòng vô tính BAC, nó lai với đa phần cùng những dòng vô tính BAC nhận diện bởi một dấu RFLP khác, 55-1-E. Tuy nhiên, hai dấu là >50 cM riêng và tách riêng bởi chín dấu dùng trong nghiên cứu này (Hình 4). Lúc đầu chúng tôi giải trình kết quả này như một đảo đoạn nhiễm sắc thể có thể thực hiện. Dựa trên giả thuyết này, chún tôi mong đợi các dấu 21-3-E và 55-1-E sẽ liên kết rất gần hoặc cùng phân huỷ  trên một cặp lai giữa nòi 70-15, từ đó thư viện BAC ược xây dựng, và nòi 2539. Tuy nhiên, phân tích liên kết cho thấy chúng là ~40 cM riêng trong một quần thể F1 cá thể 61 (số liệu không trình bày). Để nghiên cứu thêm việc này, DNA từ hai dấu RFLP được chế phẩm lại từ những dòng vô tính mới. Lần này, dấu 21-3-E nhận diện những dòng vô tính BAC trong một contig FPC rắn có những dấu RFLP lân cận mong đợi 39 và 4-196. Vì thế, dựa trên những kinh nghiệm của chúng tôi, bất kể khi nào có thể thực hiện và thực hành, hai hoặc nhiều hơn phương pháp tiếp cận không phụ thuộc gồm có việc phân tích di truyền phải được dùng để có những kết quả khoẻ và có thể tin cậy. Bằng cách áp dụng nguyên tắc này, chúng tôi có thể xây dựng với lòng tin một bản đồ vật lý của một nhiễm sắc thể 4,2 Mb.

Một lát tối thiểu có 42 dòng vô tính BAC cũng được xác định dựa trên những vị trí địa lý của chúng trong các contigs. Vì, tính trung bình, ~23 băng HindIII (>1 kb) được tạo ra bởi một dòng vô tính BAC, khoảng cách giữa hai dòng vô tính BAC kế cận nhau được tính toán dựa trếnố lượng băng chia sẻ. Dựa trên lát tối thiểu, những phân bố DNA lập lại và gien được nghiên cứu. Như đã tìm thấy trong những công trình nghiên cứu trước trên M. grisea (Nitta et al. 1997) và những sinh vật khác, như là Aspergillus nidulans (Prade et al.1997) và Caenorhabditis elegans (The C. elegans Sequencing Consortium 1998), những yếu tố lập lại có xu thế chia nhóm trên nhiễm sắc thể 7. Cũng đáng lưu ý là trong vài miền gien và DNA lập lại cũng có xu thế chia nhóm. Vì đa phần DNA lập lại thuộc về những yếu tố giống transposon (gien nhảy). Điều có thể thực hiện là những miền giàu gien gây hại nhiều hơn cho việc chèn gien bởi transposons hoạt động trong quá trình tiến hoá.

Như là một kết quả trực tiếp thành công của công trình nghiên cứu này, thư viện BAC hoàn toàn đang được in dấu tay và tập hợp vào contigs. Các contigs sẽ bị neo vào các nhiễm sắc thể bằng cách lai tạo với mọi dấu di truyền có sẵn. ESTs cũng sẽ được dùng như những con dò lai tạo trong việc hỗ trợ với tập hợp bản đồ vật lý. Điều này sẽ đồng thờivẽ bản đồ ESTs. Ngoài ra, các chuỗi cuối của các dòng vô tính BAC đang nhận. Vì số lượng ~10,000 gien trên bộ genome M. grisea. Các chuỗi cuối sẽ hành động như thể liên kết nhãn chuỗi (STCs) và khi kết đôi với contigs tập hợp sẽ cung cấp một khung làm việc có sẵn chuỗi và một trình bày vật lý của tổ chức của một số lượng đáng kể gien thông qua bộ genome hoàn toàn.

Phương pháp

Con dò DNA và thư viện BAC

Các dấu RFLP trên nhiễm sắc thể 7 là tặng phẩm của S. A. Leong, trường đại học Wisconsin (Nitta et al 1997). Các dấu dùng trong nghiên cứu này được trình bày như sau: G13IR, cos209, CH5-177H, 23-4-D, 10-6-B, CH5-75H, 33-2-A, 21-3-E, 4-196, 39, 23-9-GI, cos156, CH2-32H, CH3-85H, MAT1-1, 32-8-A, 40-12-, 55-1-E, CH5-58H, và A14C9. Gien kiểu giao phối MAT1-1 là PCR khuếch đại từ nòi 70-15 dựa trên những con mồi trình bày bởi Kang et al. (1994). Các dòng vô tính plasmid của Pot2, MAGGY, và MGR 586 do Dr. S. Leong gửi tặng. Những dòng vô tính POR6 là tặng phẩm từ Dr. L. H. Zhu (Zhu và Zhu 1993). Một yếu tố Mg-SINE được nhận diện trong một dòng vô tính cDNA trong một dự án EST (W. Choi và R. A. Dean không xuất bản) Thư viện BAC của M. grisea dã trình bày trước (Zhu et al. 1997).

Chế phẩm DNA và cDNA

DNA có trong lượng phân tử cao từ nòi 70-15 được phân lập theo Orbach et al. (1996). Nồng độ cuối của thể nguyên sinh gắn vào aga (Bio-Rad) có điểm nung chảy thấp 1% (LMP) là 1 x 10⁹/ml.

DNA từ những dòng vô tính BAC được chế phẩm bằng tay hoặc bởi robot AutoGen 740 (AutoGen Inc.). Nói tóm lại, 5 ml cháo LB (Sigma) có 12,5 mg/ml chloramphenicol (Sigma) được chủng với một dòng vô tính BAC đơn theo sau bởi phát triển ở 37^oC được lắc ở 250 vòng/phút trong 20 tiếng đồng hồ. BAC DNA được trích theo một phương pháp tiêu giải chất kiềm trình bày bởi Woo et al. (1994). Một cách luân phiên, BAC DNA còn được chế phẩm bằng cách dùng một robot AutoGen 740 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mọi DNA được hoà tan trong 30 ml chất đệm 1 mM Tris-HCl (pH8,0).

RNA được chế phẩm từ giác bám và thể sợi từ nòi 70-15 lây nhiễm cây lúa (Zhu et al. 1996). Để chế phẩm can iai đoạn giác bám, RNA tổng số được trích sau 4 tiếng đồng hồ chủng bào tử đính (conidia) trên bề mặt kỵ nước có thể suy diễn. Vào thời gian này, 5%-10% bào tử đính tạo ra giác bám. Với RNA của thể sợi, bào tử đính được chủng trong một môi trường nước hoàn toàn và cho phép phát triển trong 3 ngày. RNA sau đó được trích bằng cách sử dụng các phương pháp chuẩn (Sambrook et al. 1989). cDNA dùng như những con dò lai tạo được chế phẩm bằng cách sử dụng một bộ công cụ tổn hợp cDNA từ Stratagene.

PFGE

Hiện tượng điện di trên jel xung trường (PFGE) được thực hiện bằng cách sử dụng 0,7% SeaKem LE jel aga (FMC) trong 0,5 x TBE ở 14^oC bằng cách sử dụng một hệ thống CHEF-DRII (Bio-Rad). Khoảng cách cầu dao đã dùng là 90 phút trong 5 ngày, sau đó 60 phút trong 2 ngày, ở 1,2 V/cm.

Nhãn cuối độc hướng

Các đầu BAC được nhãn bởi phương pháp PCR độc hướng như đã trình bày trước (Zhu et al. 1997). Hai con mồi đã dùn là BACL (5’-TCGACCTGCAGGCATC-3’) và BACR (5’-GACACTATAGAATACTCAAG-3’). PCR độc hướng được thực hiện trong một khối lượng 50-µl có đệm phản ứng (Epicenter), 100 µM mỗi nucleotide (trừ dCTP; 1 µM), 20 µCi của [a-³²P]CTP (3000 Ci/mmole), 2,5 mM Mg²⁺, 2 mM con mồi BACL hoặc BACR, 100 ng của BAC DNA, và 1 đơn vị Tfl polymerase (Epicenter). Tiếp theo 5 phút ở 94^oC, 35 chu kỳ 90^oC trong 1 phút, 52^oC trong 1 phút, và 72^oC trong 5 phút được thực hiện. Các sản phẩm phản ứng được tinh lọc bởi sắc tố ký Sephadex G-50 (Sigma) và dùng như những con dò.

Nhận diện những dòng vô tính BAC sao đơn chuyên tính nhiễm sắc thể 7

Để nhận diện những dòng vô tính BAC chỉ có những đoạn DNA sao đơn hoặc thấp, DNA genomic tổng số từ 70-15 nhãn với [a-³²P]CTP dùng một phương pháp tiếp cận nhãn ngẫu nhiên (Amersham) và lai chống lại các bộ phận lọc khuẩn lạc có 4508 dòng vô tính (biểu hiện >độ che phủ genome gấp 12 lần). Các khuẩn lạc dó cho các tín hiệu lai có thể nhìn thấy được được xem xét như là có DNA lập lại và được lấy đi khỏi thư viện. Những dòng vô tính BAC (số lượng 2137) nhận diện như có DNA sao đơn được trình bày lại trên những bộ phận lọc mới dùng một trung tâm hoạt động tự động BioMek 2000 (Beckman) (Zhu et al. 1997). Để có những dòng vô tính BAC chuyên tính nhiễm sắc thể 7, DNA của nhiễm sắc thể 7 được tách riêng từ những dòng khác trên một jel CHEF, cắt và phục hồi với GênClean (Bio 101), nhãn với [a-³²P]CTP (Amersham), và lai chống lại các bộ lọc mới. Cùng các bộ lọc sau đó dược cởi ra và lai với DNA nhãn bức xạ từ  những nhiễm thể còn lại phân lập với phương pháp trên.

Tiêu hoá enzym ức chế cắt

Những tiêu hoá ức chế cắt cá thể gồm có 3,5 (l ddH20, 1 (l  10 x đệm E, 1 (l  10 x BSA, 0,5 (l HindIII (80 U/(l ; Promega), và 4 (l  DNA. Tiêu ức chế cắt được tiến hành ở 37^oC trong ít nhất 10 giờ. Sau tiêu hoá, quay ngắn đã thu gom DNA ở đáy ống nghiệm, và 1 (l 10 x thuốc nhuộm tải (0,25% xanh bromophenol, 0,25% xylene cyanol FF, và 15% Ficoll; Sambrook et al. 1989) được thêm vào. BAC DNA tiêu hoá được tồn trữ ở -20^oC trước khi điện di trên jel aga.

Điện di trên jel aga và thu gom dữ liệu

Điện di trên jel aga được tiến hành như trình bày bởi Marra et al (1997) có một vài sửa đổi. Aga SeaKem LE (FMC) được sử dụng để chế phẩm jel 1% trên 1 x TAE. Đối với từng jel, 15o ml jel chảy được đổ vào một khay 20 x 25 cm trong suốt UV (Life Technology) dẫn đến một độ dày thạch ~3, 5 mm. Một cái lược tạo ra do thói quen hình thành 61 hốc có kích cỡ như sau: rộng 2 mm x dày 1 mm x sâu 3 mm.  Sau khi lược được lấy đi khỏi jel rắn. jel dược đặt trong máy điện di nối với một hệ thống thông lưu lại chất đệm ở 16^oC và cho phép làm mát ít nhất 30 phút trước khi tải mẫu. Chất đệm được thông lưu lại và làm lạnh trong chậu nước qua 25 bộ anh Tygon tubing (Tygon LFL 6429-17). Trong hốc đầu và mỗi 5 hốc sau đó 1 (l mẫu DNA dấu chuẩn được tải trọng. Marker DNA là một hỗn hợp của Hi -Lo DNA marker (Minnéota Molecular) và tiêu hoá ức chế cắt DNA (theo tỷ lệ saut: 10 (l Hi-Lo DNA marker, 5 (l (/HindIII (0,1 (g/(l), 1 (l  (/Stu1 (0,1(g /(l), 1 (l  (/SalI (0,1 (g /(l), 2 (l  10 x thuốc nhuộm tải, và 27 (l  H20).

Bốn microlit tiêu hoá ức chế cắt / hỗn hợp nhuộm tải của mỗi mẫu được tải trọng trong những hốc còn lại. Những mẫu tách riêng trong Model Horizon 20-25 (Life Technology) ở 90 V trong 10 giờ ở 16^oC.  Sau khi điện di, jel được lấy đi sang một khay nhựa dẻo có 100 ml một hòa tan 1:10000 SYBR Gold (Molecular Probes=mẫu dò phân tử) trong 1 x TAE (pH 8,0) và lắc trong 40 phút. Sau khi nhuộm, một ảnh của jel được chụp trong một hộp UV sử dụng phim Polaroid F55. Hình ảnh jel sau đó được quét trên trên một ScanJet 4C (Hewlett Packard) ở 600 dpi và seo như tập tin TIFF. Một cách luân phiên, ảnh jel bắt trên một Fluor -S Multilmager (Bio-Rad). Những tập tin TIFF được chuyển sang máy UNIX để gọi băng và tập hợp contig.

Phân tích trên máy vi tính

Đối với những khảo nghiệm lai, những vô tính BAC lai dương tính ("hits") nhận diện bởi từng mẫu dò được chấm điểm, và một ma trận nhị phân của mẫu dò và hits được tạo ra. Ma trận dữ liệu được xử lý sử dụng chương trình thuật toán chi phí ngẫu nhiên trên một hệ thống UNIX để tạo ra contigs lai như trình bày bởi Wang et al (1994).

Để nhận diện băng ức chế cắt trên BAC DNA fingerprinting, ảnh jel lưu như tập tin TIFF được phân tích bởi chương trình Image 3,3 (Sulston et al 1988, 1989). Những băng <1 kb bỏ qua trong quá trình gọi băng (band calling). Một tập tin dấu đặc hiệu được phát sinh để bình thường hóa di dộng của tất cả băng ức chế cắt. Dữ liệu gọi băng được thu gom và chuyển sang chương trình FPC 3, 2 để thực hiện tập hợp contig tự động hóa. Cả hai ảnh và FPC được tải xuống từ  HYPERLINK http://www.sanger.ac.uk. Software http://www.sanger.ac.uk.  Software (Soderlund et al 1997). Hai tham số chính sử dụng trong tập hợp contig FPC có tính chịu và giá trị cắt. Từ tham khảo như là kích cỡ cửa sổ di động tương đối. Thí dụ, khi tính chịu được chỉnh ở 7, hai gien ức chế cắt được xem là tương đương nếu tính động tương đối ở trong khoảng (7x0,01) x (rộng trung bình của 2 băng) (FPC V3; Sổ tay người sử dụng). Điểm cắt (cutoff) tham khảo phương pháp chấm điểm của Sulston; xác suất của những băng phù hợp là một trùng lắp. Điều kiện cho một trường hợp gối nhau không trùng lắp giữa hai vô tính trở thành nghiêm ngặt như là tham số cắt bị hạ thấp. Trong phân tích FPC của chúng tôi, một tính chịu cố định 7 được sử dụng dựa trên khảo nghiệm sơ khởi, và những tập hợp contig được thực hiện ở những giá trị cắt khác nhau thay đổi từ 10^-7 đến 10^-9. Để vẽ bản đồ chi tiết những contigs lớn được tạo ra ở giá trị cắt hoặc là 10^-8 hoặc 10^-9, thuật toán CB (Soderlund et al 1997) được sử dụng để khảo nghiệm thứ tự của vô tính BAC trong những contigs riêng có giá trị cắt giảm của 10^-10.           

Tổ chức của những yếu tố nhắc lại và gien hiển thị

Để tạo ra một đường dẫn tiling tối thiểu của nhiễm thể 7, vô tính BAC rườm rà được lấy đi khỏi bản đồ vật lý. Độ dài của những vùng trùng lắp được xác định sẽ là ~30 kb dựa trên số gien ức chế cắt chia xẻ [nghĩa là (6 gien chia xẻ /25 gien tổng cộng) x 130 kb = ~30 kb]. Điều này dẫn đến xây dựng một tile tối thiểu BAC có 42 vô tính BAC che phủ >95% nhiễm thể. 42 vô tính BAC được tiêu hoá với HindIII đến hoàn tất, và DNA được tách riêng trên jel aga phân tích, theo sau bởi chuyển Southern trên những màng nylon. Những màng này được lai riêng với DNA genomic tổng số nhãn 32P, POR6, Mg-SINE, MGR586, MAGGY, mẫu dò Pot2, và hai mẫu dò cDNA tổng hợp từ những giác bám và khuẩn ty. Số gien HindIII của 42 vô tính BAC trong tile nhỏ nhất lai với từng mẫu dò được ghi chép.

RGC (Ngày 30-03-2007)  (Physical Map and Organization of Chromosome 7 in the Rice Blast Fungus, M. grisea)

Trở về Trang Chính