Dẫn luận

Tính chuyên biệt hoá của cây ký chủ trên bệnh cháy lá lúa, do nấm Magnaporthe grisea (cùng dạng, Pyricularia grisea) (Rossman et al., 1990), đã kích thích óc tò mò của các nhà thảo mộc bệnh học nhiều thế hệ vì một số rất lớn các chủng nấm chuyên biệt hoá giống trồng và vì tiềm tàng lớn nấm biến đổi, có khả năng lây lan trước các giống lúa kháng. Chương này sẽ mô tả làm thế nào sự phân tích di truyền hiện đại trả lời các vấn đề chính về các cơ chế của tính chuyên biệt ký chủ và tính bất ổn định di truyền trên nấm gây bệnh cháy lá lúa.

Các gen vô tính đối với tính chuyên biệt hoá ký chủ C, như là gen tính không độc tố (AVR), đang phục vụ như là các công cụ có giá trị để phân tích các cơ chế di truyền phân tử xác định tính chuyên biệt hoá giống trồng -ký chủ và loài -ký chủ. Nghiên cứu thêm về các sản phẩm của gen AVR sẽ nâng cao kiến thức về các cơ chế sinh hoá xác định tính chuyên biệt hoá giống trồng -dòng. Như là các con dò phân tử, các gen AVR vô tính nay đang được sử dụng để nghiên cứu sự phân bố các gen trên trong quần thể nấm. Các phân tích của kiểu này sẽ cho phép xác định có thể tin cậy hơn về tiềm tàng của biến đổi trong quần thể gây bệnh như là một tập thể. Tất cảc các nghiên cứu này sẽ tạo ra cách nhìn sâu quan trọng để phòng trừ bệnh cháy lá ngoài đồng.

Khả năng biến đổi di truyền là một đặc tính phổ biến nuôi trồng bệnh cháy lá trong phòng thí nghiệm. Khảo sát cẩn thận đã cho biết là tính ổn định di truyền hay bất ổn định là đặc tính của các lô cút đặc biệt trên các dòng riêng biệt. Nghĩa là, tính bất ổn định trên nấm gây bệnh cháy lá chỉ được liên kết với một số lô cút di truyền, và các lô cút di truyền thì không ổn định trên một số dòng nấm hình như sẽ là ổn định trên các dòng khác. Sự phân tích bằng cách sử dụng các gen vô tính đã cho biết cơ sở phân tử để thay đổi tại các lô cút bất ổn định. Thí dụ, việc nhân giống vô tính gen sinh tổng hợp melanin, BUF1, đã xác lập là cơ sở phân tử đối với tính bất ổn định tại lô cút di truyền này là sự mất đoạn thường xuyên. Sự phân tích các biến cố biến đổi trên các gen chuyên biệt hoá ký chủ không ổn định, PWL12 và AVR -YAMO, đã hỗ trợ trong việc nhân giống vô tính hai gen AVR và làm cho quán triệt cơ chế của tính bất ổn định gắn với từng gen, như được trình bày dưới đây.

Một phương pháp tiếp cận có giá trị để nghiên cứu biến đổi di truyền trên nấm gây bệnh cháy lá là việc sử dụng các chuỗi DNA lập lại như các con dò lai tạo để mô tả đặc tính các dòng thông qua “phương pháp in DNA”. Phương pháp in DNA đã được sử dụng để giải quyết các vấn đề về tính ổn định của tính chuyên biệt hoá ký chủ ngoài đồng (Levy et al. 1991, 1993). Quần thể gây bệnh trên lúa ngoài đồng hình như sẽ là vô tính. Có nghiã là, các chủng ở ngoài đồng lây lan trên cây lúa có thể được phân nhóm thành các dòng dõi riêng biệt (kiểu đơn = haplotypes), dựa trên tính đồng dạng của in DNA bằng cách sử dụng MGR586 như là một con dò (Hamer et al. 1989; Levy et al. 1993; Shull và Hamer, sách này). Các chuỗi DNA có lập lại còn là các con dò giá trị để xác minh tương quan bố mẹ /biến đổi, sẽ được trình bày trong chương này. Trong trường hợp bệnh cháy lá trên cây lúa mì tại Braxin, giả thuyết là tác nhân gây bệnh cháy lá trên lúa mì được được phát sinh bởi biến đổi từ tác nhân gây bệnh lúa được chứng minh là sai bởi phương pháp in MGR (F.G. Chumley và B. Valent, kết quả không công bố).

Bệnh cháy lá như là một hệ thống gen -đối-gen

Các chủng cá thể của M. grisea có nhiều ký chủ giới hạn. Các dòng (kiểu bệnh) của nấm được phân biệt trong số các chủng ký sinh trên cây lúa, lệ thuộc vào các giống lúa trồng chúng lây lan thành công (Atkins et al.., 1967; Ling và Ou, 1969); Yamada et al. 1976). Cơ chế theo đó các dòng mới của một tác nhân gây bệnh tạo ra một vấn đề kích thích óc tò mò. Dù cho qui mô của tính bất ổn định trên các yếu tố quyết định dòng đã được thảo luận (Latterell, 1975; Ou, 1985), rõ ràng là các dòng mới xuất hiện nhanh ở ngoài đồng khi các giống lúa trồng kháng bệnh cháy lá mới được đưa vào. Giả thuyết hoạt động với các nhà nghiên cứu bệnh cháy lá trên cây lúa là hệ thống bệnh cháy lá thể hiện một hệ thống “gen -đối-gen” lần đầu tiên được xác định bởi Flor (1971). Giả thuyết này nói là đối với từng gen kháng chính trội trên ký chủ, có một gen trội tương ứng đối với tính không độc tố được mang bởi tác nhân gây bệnh. Do đó, có một tương quan hoạt động một -đối-một giữa các gen kháng trên cây ký chủ và các gen AVR trên tác nhân gây bệnh. Đã có dự kiến trước là một tác nhân gây bệnh trên cây lúa có thể có khả năng lây lan trên một giống lúa trồng đặc biệt chỉ khi tác nhân gây bệnh thiếu tất cả các gen AVR tương ứng với các gen kháng của ký chủ.

Bằng chứng đang tích luỹ hệ thống cháy lá lúa thật ra là một hệ thống gen - đối- gen. Nhiều nhà nghiên cứu nay đã báo cáo sự thoái hoá Menđen của các gen đơn điều khiển tính chuyên biệt hoá giống trồng trên tác nhân gây bệnh (Leung et al. 1988; Ellingboe et al. 1990; Valent et al. 1991; Silue et al. 1992 a, b). Hình như còn là các gen AVR được nhận dạng trên nấm tương ứng với gen kháng trội trên cây ký chủ như được dự báo bởi mô hình gen -đối-gen (Silue et al., 1992a). Tính trội của các gen AVR khó xác lập, vì tính trội không thể được xác định đối với các gen của M. grisea bằng các phương pháp cổ điển (Crawford et al., 1986). Vì vậy, việc xác lập tính trội đầu tiên đòi hỏi nhân giống vô tính gen AVR, và về mục đích này, điều nói trên có ích để giả định là gen AVR có thể được phát hiện bởi khả năng của chúng để biến đổi một dòng có độc tố của nấm thành một dòng không độc tố (Hình 7. 1a).

Một dự báo thứ hai của giả thuyết gen -đối-gen là các biến đổi phải xảy ra là thay đổi kiểu hình của một dòng từ không độc tố (kiểu hình trội do tác động của một gen AVR) sang có độc tố (kiểu hình liệt do mất đi hoạt động của gen AVR; Hình 7.1b). Thật vậy, nhiều biến đổi trên là phổ biến từ một số dòng M. grisea trong các điều kiện phòng thí nghiệm. Một tần số biến đổi cao tại một số lô cút di truyền trong phòng thí nghiệm có thể hoặc không thể phản ánh tập tính của nấm ngoài đồng. Tuy nhiên, các cơ chế của biến đổi di truyền có thể dược mong muốn sẽ là giống nhau trong phòng thí nghiệm và ở ngoài đồng. Vấn đề là làm thế nào nghiên cứu bất kỳ hệ phát sinh bệnh trong phòng thí nghiệm liên quan đến tình hình ngoài đồng phải được xem xét cẩn thận.

Hình 7.1  (A) Kiểu hình dự báo đối với “gen không có độc tố” (AVR gene) là sự hiện diện của một gen hoạt động qui đổi một dòng có độc tố (gây bệnh) của nấm thành một dòng không độc tố (không gây bệnh). Vì vậy, thí nghiệm duy nhất đối với các gen này là sự biến đổi (Parsons et al. 1987; Leung et al. 1990) của một dòng chứa có độc tố có plasmids cá thể từ một thư viện gen M. grisea. Các biến đổi cá thể được thanh lọc về thiệt hại chuyên biệt hoá khả năng lây lan cây ký chủ đang quan tâm, AVR2-YAMO, PWL2 và PWL1 tất cả qui đổi kiểu hình của một tác nhân gây bệnh từ có độc tố sang không độc tố. (B) Thiệt hại hoạt động của một gen AVR đoán chừng phải là kết quả lây lan có thể trên một cây ký chủ đặc biệt. Sự phân lập nấm khỏi “vết thương hiếm” nhận được sau khi lây lan với một dòng không độc mang lại sự hồi phục của một dòng biến đổi nay tàn phá cây ký chủ đặc biệt. Một số gen chuyên biệt hoá ký chủ, PWL2, AVR2-YAMO và Avr1 -TSUY, hình như sẽ là “không ổn định”. Có nghĩa là, các dòng biến đổi tự phát phát sinh từ các dòng mang các alen không độc tố (hay không gây bệnh) của các gen trên xuất hiện thường trong các thí nghiệm chuẩn. Không có dòng có độc tố đã được hồi phục từ các dòng mang Avr1 -CO39, Avr1-M201, Avr1-YAMO và PWL1 trong các thí nghiệm lây lan tương tự. Do đó, 4 gen cuối này được xem sẽ là “ổn định” liên quan với các gen không ổn định PWL2, AVR2-YAMO và Avr1 -TSUY (Bảng 7.1) (Trang 113) (trang 113)

Bảng 7.1  Các gen được nhận dạng chuyên biệt hoá cây ký chủ trên M. grisea

^a  Gen vô tính nay có tên với tất cả các chữ cái (“AVR”), phù hợp với thuật ngữ di truyền chuẩn đối với các gen trội. Tính trội không chứng minh đối với gen thường (uncloned=không vô tính), các gen này vẫn giữ tên gen “Avr”

^b  “Nguồn” được trình bày đối với từng gen dựa trên tính lây lan của bố mẹ trên cặp lai trong đó gen được nhận dạng. Nguồn được trình bầy là dòng bố mẹ đã mang alen đối với tính không gây bệnh hay tính không độc tố. WLG cho biết cỏ khốc tình thảo “weeping lovegrass” (Eragrostis curvula). GG cho biết cỏ mần trầu (goosegrass=Eleusine indica) nhưng các chủng không lây lan các Eleusine spp. khác gồm có cỏ chân nhện “finger millet”. Khi nguồn đã biết sẽ là chủng ở ngoài đồng, dòng sẽ có tên.

^c Một yếu tố quyết định tính chuyên biệt hoá ký chủ được trình bày như là “không ổn định” nếu các biến đổi có độc tố hay gây bệnh xuất hiện với tần số cao, như được trình bày trong bài và Hình 7.1b.

Việc hiểu rõ các yếu tố quyết định của tính chuyên biệt hoá trong một số dòng gây bệnh là bước tứ nhất đi về phía hiểu rõ các đặc tính của một quần thể phức tạp hơn.

Dù cho chương này tập trung vào các thí dụ về tính bất ổn định di truyền, các thí dụ này phải được sử dụng như là trình bày cơ sở phân tử đối với biến đổi, và không phải như là chỉ dấu của tập tính của các quần thể gây bệnh trên lúa như là một tập thể. Chúng tôi mô tả ở đây các gen vô tính đầu tiên phòng trừ tính chuyên biệt hoá ký chủ trên nấm gây bệnh cháy lá lúa. Một gen PWL2 hoạt động, mã một protein chứa 145 amino acids, ngăn cản nấm khỏi lây lan trên “weeping lovegrass”, Eragrostis curvula. Chúng tôi tham khảo PWL2 như là một gen AVR vì nó có các đặc tính di truyền chính thức giống như các đặc tính của các gen AVR. Một gen AVR2 -YAMO hoạt động, mã một protein có 223 amino acids, ngăn cản nấm khỏi lây lan trên giống lúa Yashiro -mochi. Các chuỗi DNA có tính đồng dạng mạnh với cả hai PWL2 và AVR2 -YAMO hiện diện trong hầu hết tác nhân gây bệnh trên lúa và trên hầu hết các tác nhân gây bệnh trên Digitaria. Các tương ứng hoạt động của cả hai kiểu gen, gồm có gen PWL1 được nhận dạng từ trước, đã được nhân giống vô tính từ các dòng nấm lây lan các loài cỏ khác hơn là lúa.

Các lô cút ổn định và không ổn định

Các chủng M. grisea có xu thế sẽ là không ổn định liên quan đến một số đặc tính hình thái học, tính thụ, và tính phát sinh bệnh trong thời gian cấy lại trong phòng thí nghiệm (Valent và Chumley, 1991), như điển hình của nhiều tác nhân gây bệnh nấm. Thí dụ, một số dòng nấm, gồm có tác nhân gây bệnh trên lúa cũng như tác nhân gây bệnh trên các loài hoà bản khác, cho thấy ngoại hình tự phát thường xuyên của các biến đổi có hình thái bào tử thay đổi do các biến đổi trên gen SMO1 (Hamer et al. 1989; Hamer và Givan, 1990). Các biến đổi này cho biết các kiểu hình tính phát sinh bệnh thay đổi trên lúa. Trong các lần cấy lại trong phòng thí nghiệm, nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa đã thu thập từ ngoài đồng trên thế giới cho biết tính bất ổn định di truyền đối với biểu hiện của BUF1, gen sinh tổng hợp melanin, cần cho việc lây lan cây trồng không thương tích (Chumley và Valent, 1990; Howard và Ferrari, 1989; chương 1, sách này). Vì các biến đổi xảy ra khi nấm được cấy lại trên môi trường cấy aga, quan trọng là việc cấy lại nấm được giữ ở mức thấp nhất, tốt hơn bằng cách duy trì số lượng dự trữ thường xuyên trong điều kiện đông lạnh, không biến dưỡng (Valent et al. 1991).

Tuy nhiên, khả năng biến đổi cao, không phải là đặc tính chung của gen M. grisea. Nhiều gen xuất hiện biến đổi ở tần số thường, gồm có ALB ⁺ và SRY ⁺, mã các emzim sinh tổng hợp melanin (Chumley và Valent, 1990). Các quần tụ dinh dưỡng thụ động (auxotrophic colonies) được hồi phục ở một tần số khoảng 0,35% sống sót của phát sinh biến đổi UV trong đó koảng 95% quần thể bắt đầu bị tử vong (Crawford et al. 1986). Tần số này phù hợp với mong muốn đối với một nấm đơn bội điển hình. Các biến đổi tự phát  kháng 6-methylpurine, sulfonylurea chlorimuton ethyl (Dupont Agricultural Products;DPX-F6025) hay benomyl được phân lập trong các thí nghiệm độc lập ở các tần số 10^-6-10^-7 (F.G. Chumley, tài liệu không công bố). Các tần số “thường” đối với sự hồi phục của các biến đổi trên một quần thể nấm đơn bội ngược lại rất nhiều với tần số rất cao của các biến đổi buf ^- và smo ^- tự phát, và với tần số cao của một số các biến đổi tính chuyên biệt hoá ký chủ.

Một phân tích phân tử được thực hiện với mục đích hiểu rõ tại sao gen BUF1 lại không bền trên một số dòng của tác nhân gây bệnh. Tác nhân gây bệnh trên lúa Trung Quốc O -137 cho biết tính bất ổn định cực kỳ nhất ở lô cút này. Khoảng 0,25% số bào tử tử đính được tạo ra bởi O -137 trong vụ cấy lại trong phòng thí nghiệm mang các biến đổi buf ^-. Các biến đổi buf ^- tự phát thỉnh thoảng xảy ra trong giai đoạn sinh dưỡng của các tác nhân gây bệnh trên lúa khác, gồm có O -135 và Guy11, nhưng ở một tần số thấp hơn so với O -137. Nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa lai với các dòng có sắc tố thường khác để tạo ra 5-25% con cháu buf ^- (Leung et al. 1988; Chumley và Valent, 1990; Valent et al. 1991), cho biết là tính bất ổn định xảy ra trong giai đoạn phân bào giảm nhiễm (meiosis). Để hiểu rõ tính chất của biến đổi, Leonard Parrall nhân giống vô tính gen BUF1 từ một thư viện gen bằng việc bổ sung một khuyết tật buf ^- trên một dòng biến đổi. Phân tích lai tạo Southern được thực hiện bằng cách sử dụng một plasmid BUF1 như là một con dò để phát hiện các thay đổi cấu trúc tại lô cút BUF1 (Hình 7.2). Các biến đổi phát sinh từ ba chủng ngoài đồng lây lan cây lúa và hai dòng trong phòng thí nghiệm lây lan cỏ “weeping lovegrass” và /hay “finger millet” (Eleusine coracana) tất cả chứa các trường hợp mất đoạn (deletions) của gen BUF1 và các chuỗi genome kế cận (L. Farrall, F.G. Chumley, và B. Valent, kết quả không công bố). Các ca mất đoạn có thể rất lớn. Các biến đổi nhận được từ 0-135 và Guy 11 mất tất cả tính tương đồng của 40 kb chuỗi genome bao gồm trong con dò lai tạo. Đối với một dòng nấm đặc biệt, các điểm mất đoạn hình như sẽ là giống nhau trong các biến đổi phát sinh một cách độc lập xảy ra trong giai đoạn sinh dưỡng hay trong chu kỳ tính dục. Chúng tôi đặt giả thuyết là các gen BUF1 không ổn định bị mất đoạn do sự tái tổ hợp đồng nhất của các chuỗi DNA lập lại bọc sườn. Có nhiều tài liệu được sưu tập là các chuỗi DNA có lập lại có thể làm mất ổn định các vùng của bộ genome trong nhiều sinh vật (Peters và Hill, 1988). Chúng tôi giả định là trong một số trường hợp cách biệt giữa các lô cút bền và không bền là các lô cứt không bền được cắt ở sườn bởi các chuỗi DNA có lập lại ở nơi nào không có các lô cút bền.

Các gen chính điều khiển tính chuyên biệt hoá ký chủ là phổ biến

Nhiều phòng thí nghiệm đã đầu tư nỗ lực đáng kể để nhận dạng các gen điều khiển chuyên tính ký chủ trên M. grisea (Leung et al. 1988; Ellingboe et al. 1990; Valent et al. 1991; Silue et al. 1992a, b). Trong phần thảo luận dưới đây, chúng tôi sẽ tập chú vào các “gen chính” (các gen đơn có một hiệu ứng có - tất- cả-hay-không trên kiểu hình) đã được nhận dạng trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Bảng 7.1). Các gen “nhỏ” có hiệu ứng nhỏ cá thể cũng được phát hiện (Valent et al., 1991), nhưng các gen này sẽ không được thảo luận ở đây. Trên một cặp lai giữa tác nhân gây bệnh trên”finger millet”, WGG-FA40, và tác nhân gây bệnh trên “weeping lovegrass”, K76-79. Valent et al. (1986) đã xác định một gen đơn, có tên là PWL1, xác định tính có độc tố về phía weeping lovegrass. Sự thoái hóa của FWL1 được xác nhận trong các cặp lai kế tiếp. Gen này hẳn sẽ là cùng gen được mô tả bởi Yaegachi (1978). Một gen tương tự, PWL2, điều khiển khả năng lây lan weeping lovegrass được nhận dạng trên cặp lai vẽ bản đồ được mô tả dưới đây.

Ba gen không độc tố Avr1 -CO39, Avr1-M201 và Avr1 -YAMO (Bảng 7.1) điều khiển chuyên tính về phía các giống lúa trồng CO39, M201 và Yashiro -mochi, tương ứng. Các gen này được nhận dạng trong một nghiên cứu hồi giao mở rộng được thực hiện để xác định cách biệt di truyền giữa O -135, một tác nhân gây bệnh trên lúa Trung Quốc, và dòng 4091-5-8, một dòng trong phòng thí nghiệm lây lan weeping lovegrass, nhưng không tạo ra triệu chứng trên cây lúa (Valent et al., 1991). Avr1-CO39, Acr1-M201 và Avr1 -YAMO hình như sẽ được phát sinh từ dòng 4091-5-8 nên chúng hoặc là đến xuất xứ từ tác nhân gây bệnh trên Eragrostis K76 -79 hay tác nhân gây bệnh trên Eleusine WGG-FA40 (Valent et al., 1986). Yaegashi và Asaga (1981) đã báo cáo bằng chứng tình huống mạnh là một tác nhân gây bệnh trên finger millet, WGG-FA40, mang một gen AVR tương ứng với gen kháng bệnh cháy lá Pi -a. Các kết quả di truyền này tất cả đã đề xuất các gen AVR chuyên biệt hóa đối với các giống lúa trồng là phổ biến trên các tác nhân gây bệnh M. grisea của hòa bản nhiều hơn là lúa.

Hình 7.2  Tính bất ổn định tại lô cút BUF1 do sự biến đổi mất đoạn, DNAs của bộ genome được tiêu hóa với enzim giới hạn HindIII, được điện di trên jel 0,7% aga, và được truyền di đến một màng lai tạo. Các vết thấm được dò với một plasmid có nhãn ³²P chứa một đoạn gen chèn 40kb của DNA genome gồm có gen BUF1 . Từ trái qua phải, các luồng chứa DNA từ O -137, sáu biến đổi buf ^-1 độc lập phát sinh từ O -137O-135, bốn biến đổi buf ^-1 độc lập từ O -135, Guy11, một biến đổi buf ^-1 từ Guy11, 4091-1-3 và hai biến đổi buf ^-1 từ nòi này, 4091-5-3, và một biến đổi buf ^-1. Các vị trí được đánh dấu về các tiêu chuẩn kích cỡ (phía trên) 23,1kb, 9,4kb, 6,6kb, 4,4kb, 2, 3kb và 2,0kb. (Trang 117)

Các gen AVR khác được nhận dạng trên một chuỗi thứ hai của các cặp lai được trình bày trong Hình 7.3. Trên cặp lai 4360, dòng cha mẹ 4224-7-8 không có độc tố trên các giống lúa trồng Yashiro -mochi, Maratelli và Tsuyuake, nhưng có độc tố trên các giống lúa trồng CO39, M201 và Sariceltik. Bố mẹ thứ hai, dònng 6043 (Leung et al., 1988) có độc tố trên tất cả các giống lúa trồng này. Dòng 4224-7-8 là một tac nhân gây bệnh trên weeping lovegrass, nhưng dòng 6043 thì không. Các số liệu của năm thể tứ trọn vẹn (một thể tứ tượng trưng được trình bày trong Bảng 7.2) và của 67 môi trường cấy bào tử túi (ascospores) ngẫu nhiên dễ xuất là các gien đơn khác nhau điều khiển từng thí dụ của chuyên tính ký chủ. Sự thoái hóa giản đơn được khảo sát trong các cách biệt tất -cả-có-hay-là-không trong khả năng lây lan mỗi trong ba giống lúa trồng này và weeping grass. Các cặp lai khác xác nhận sự thoái hóa của từng gen trong các gen AVR giả định này (B. Valent, L. Farrall, và F.G. Chumley, kết quả không công bố).

Như được tóm tắt trong Bảng 7.1 hai gien điều khiển khả năng lây lan giống trồn Yashira -mochi đã được nhận dạng từ các nền di truyền khác nhau. Các cặp lai di truyền được thực hiện để xác định nếu AVR2 -YAMO, phát sinh từ một tác nhân gây bệnh trên cây lúa, có alen với Avr1 -YAMO, phát sinh từ một tác nhân gây bệnh trên hoà bản (cỏ). Các số liệu của ba cặp lai khác nhau cho biết là hai gien không gắn kết lẫn nhau. Các số liệu đầu tiên còn đễ xuất là PWL1, từ một tác nhân gây bệnh trên finger millet, và PWL2, từ một tác nhân gây bệnh trên lúa, không được liên kết. Vì vậy, trong cả hai trường hợp, có hoặc là hai gen riêng biệt, hay cùng gen ở các vị trí khác nhau trên các dòng bố mẹ.

Hình 7.3  Con cháu của các dòng M. grisea. Các bố mẹ trên cặp lai 4360 (sử dụng để vẽ một bản đồ di truyền RFLP trong Hình 7.5) là các dòng 4224-7-8 và 6043. Dòng 4224-7-8 phát sinh từ một chuỗi cặp lai liên quan đến bốn chủng ngoài đồng, tác nhân gây bệnh trên Eleusine WGG -FA40 (từ H. Yaegashi, Tsukuba, Nhật Bản) và tác nhân gây bệnh trên lúa Ken60 -19 (từ H. Yaegashi, Tsukuba, Nhật Bản), O-111 (CH-104-2 từ S.H. Ou) và O -137 (được thu thập bởi B.Valent  và Shen Ying, Viện Nghiên cứu Lúa Quốc gia Trung Quốc, Hangzhou, Trung quốc)). Dòng 6043 được cung cấp rộng rãi bởi H. Leung (trường đại học Bang Washington). Xem Leung et al. (1988) đối với con cháu của 6043. Các dòng nguồn đôiư với các gen không độc tố vô tính được trình bày. (Trang 118)

Một số gen chuyên tính ký chủ là không ổn định

Một số tác nhân gây bệnh trên lúa được phân lập khỏi ruộng tại miền Trung Trung -Quốc thường thay đổi chuyên tính về phía một số giống lúa trồng trong các nghiên cứu trong phòng thí  nghiệm (B. Valent, khảo sát không được công bố). Có nghĩa là, các biến đổi có độc tố tự phát thường xuất hiện trong các thí nghiệm lây lan chuẩn (Hình7.1b). Thí dụ, dòng O -137 biến đổi để trở thành có độc tố trên giống lúa trồng Yashiro -mochi không có thay đổi chuyên tính về phía nhiều giống trồng khác. Tương tự, chúng tôi đã phân lập nhiều các biến đổi độc lập đã trở thành các tác nhân gây bệnh của weeping lovegrass. Trong một thí nghiệm điển hình, một chậu mạ lúa hay cỏ weeping lovegrass được chủng với một thể treo có chứa một tổng cộng 2 x 10⁶ bào tử đính. 80% các chủng trên tạo ra một hay các vết thương cháy lá phát triển trọn vẹn hơn. Nấm được phân lập từ các vết thương trên đã tàn phá ký chủ gốc khi chủng lại (Hình 7.1b) nhưng không thay đổi về chuyên tính về phía nhiều cây trồng ký chủ khác. Tính bất ổn định của các yếu tố quyết định chuyên tính ký chủ này được giũ lại qua nhiều thế hệ của các cặp lai di truyền (Hình 7.3). Thí dụ, con cháu không độc tố của các cặp lai 4360 và 4375 (2-3 thế hệ cách xa bố mẹ chủng ngoài đồng không ổn định của chúng) thường biến đổi thành có độc tố trên weeping lovegrass, Yashiro-mochi, hay Tsuyuake.

Bảng 7.2  Các kiểu vết thương được tạo ra bởi bố mẹ của cặp lai 4360 và con cháu từ một thể tứ

^a Một thang điểm cho kiểu vết thương đã được xác định theo kích cỡ và sự hình thành bào tử của các vết thương được tạo ra, thay đổi từ kiểu 0, không triệu chứng có thể thấy đến kiểu 5, đặc tính của vết thương lan rộng lớn nhất của giống ký chủ (Valent et al., 1991).

Trong các thí nghiệm của chúng tôi, các dấu tay MGR586 (Hình 7.4) cũng như tính thụ, các đặc tính của quần lạc, và các chuyên tính ký chủ khác đã xác nhận là các biến đổi giả định thật ra phát sinh từ các dòng bố mẹ có tên. In DNA của MGR586 lấy mẫu cấu trúc của bộ genome tại nhiều lô cút (Hamer et al. 1989; Romao và Hamer, 1992; Sweigard et al. 1993) và biểu hiện bằng chứng xác định của tính đồng nhất vô tính của hai dòng.

Tính bất ổn định của lô cút di truyền trên các dòng trong phòng thí nghiệm đang nghiên cứu đã cho phép chúng tôi nhận được các họ của các biến đổi phát sinh từ cúng một dòng gây bệnh. Một thí dụ là họ biến đổi 4360-17-1 gồm có dòng bố mẹ không độc tố trên Yashiro -mochi, weeping lovegrass chuyên tính về phía Yashiro -mochi hay về phía weeping lovegrass, và các biến đổi đã thay đổi chuyên tính về phía cả hai ký chủ (Hình 7.4). Họ 4375-R-26 nhỏ có hai biến đổi. Trong trường hợp này, cả hai biến đổi còn có một thay đổi rõ đơn trên in MGR (các mũi tên trong Hình 7.4) Các kết quả trong phòng thí nghiệm này hình như giống nhau so với các kết quả nghiên cứu về tập hợp “mạng chuyên tính dòng dõi” MGR586 với các kiểu bệnh tại Colombia (Levy et al., 1993). Trong các nghiên cứu này, một số giới hạn kiểu bệnh được gắn kết với mỗi dòng dõi, và các kiểu bệnh liên kết khác nhau kiểu này với kiểu kia bằng các thay đổi bước đơn trên chuyên tính về phía các giống lúa trồng đơn.

Vẽ bản đồ của các gen không độc tố

Việc nhân giống vô tính các gen có hoạt động sinh hoá không biết bởi “đường đi của nhiễm sắc thể” (chromosomeawalking) đẫn đến cácđoạn gen DNA trên nhiễmgối phân khoảng vùng  từ một dấu liên kết nhân giống vô tính trước đang quan tâm. Một bản đồ di truyền có dấu với mật số cao và có thể tin cậy là điều kiện tiên quyết cho việc có các dấu di truyền liên kết chặt (Chương 7, sách này). Một cố gắng vẽ bản đồ RFLP chính của M. grisea được thực hiện và bọc sườn bất kỳ gen đang quan tâm bằng cách sử dụng các bố mẹ và con cháu cuă cặp lai 4360 để vẽ bản đồ các gen chuyên tính ký chủ, AVR2-YAMO, Avr1-MARA, Avr1-TSUY và PWL2 (Hình 7.5) (Sweigard et al., 1993). Bẩy nhóm liên kết được xác định với trên 200 dấu cơ học và di truyền. Các đoạn cuối nhiễm sắc thể (telomeres) được vẽ bản đồ bằng cách sử dụng một oligonucletide 24bp chứa bốn bản sao của thể sáu (hexamer) 5’-(AACCCT)-3’, đồng nhất với chuỗi bản sao đoạn cuối được bảo lưu cao (Schechtman, 1989).  Tất cả các gen chuyên tính ký chủ được vẽ bản đồ như các dấu Menđen thường (được trỏ bởi các mũi tên trong Hình 7.5). Một cách thích thú, gen không ổn định AVR2 -YAMO và Avr1 -TSUY cùng thoái hoá với các dấu của đoạn cuối. Bằng chứng còn đề xuất là PWL2 ở gần đầu nhiễm sắc thể, nhưng trái lại gen ổn định Avr1 -MARA ở tại vùng bên trong.

Hình 7.4  Các đấu tay DNA MGR586 xác nhận quan hệ bố mẹ -biến đổi. DNAs của bộ genome từ các dòng được thấy được tiêu hóa với EcoRI, đôiứ tượng của phân giải cao điện di trên jel aga, thấm vào một màng lai tạo và được do với các chuỗi DNA MGR586 có nhãn bức xạ (Hamer et al. 1989). (A) Sự thoái hóa Menđen của các chuỗi MGR. Các dòng bố mẹ 6043 và 4224-7-8 được so với con cháu của chúng, các dòng 4360-R-12 và 4360-17-1, Hai dòng sau cùng còn được so với con cháu của chúng (dòng 4375-R-6 và 4375-R-26). (B-D) Các họ bố mẹ -biến đổi. Các dòng 4360-17-1, 4375-R-6 và 4375-R-26 tất cả đều không có độc tố trên Yashiro -mochi và weeping lovegrass. Dòng CP917 là một biến đổi tự phát của 436—17-1 nhận tính có độc tố trên Yashiro -mochi, và các dòng CP920 và CP949 đã trở thành phát sinh bệnh trên weeping lovegrass. CP987 là một biến đổi của CP917 lây lan weeping lovegrass. Các dòng CP983 và CP951 là các biến đổi của 4375-R-6 được chọn lọc về tính có độc tố trên Yashiro -mochi và trên weeping lovegrass, tương ứng. Tương tự, các dòng CP (*$và CP963 là các biến đổi của 4375v-R-26 nhận tính có độc tố trên Yashiro -mochi và trên weping lovegrass, tương ứng. Mỗi họ bố mẹ -biến đổi đươc đánh dấu bởi một dấu tau MGR586 riêng biệt, giống hay gần giống như bố mẹ và các biến đổi. Các dấu tay của hai biến đổi được phân lập từ 4375-R-26 mỗi biến đổi thiếu một băng hiện diện trên bố mẹ (các mũi tên). Tiêu chuẩn kích cỡ cũng giống như trong Hình 7.2. (Trang 120)

Hình 7.5  Bản đồ di truyền của nấm gây bệnh cháy lá. Sự thoái hóa của trên 200 dấu gồm có gen vô tính, dòng vô tính cosmid, các yếu tố DNA lập lại, một chuỗi sao chép cuối đoạn và các gen chuyên tính ký chủ (các mũi tên) được ghi điểm đối với 66 con cháu của cặp lai 4360 (Sweigard et al.,1993). Không phải tất cả các dấu được trình bày ở đây. Việc chỉ định nhóm liên kết của một số dấu (*)được xác minh bởi sự lai tạo các vết thấm DNAs cỡñ -nhiễm sắc thể được tách riêng trên jel CHEF. Các nhiễm sắc thể đã được đánh số dựa trên tỷ lệ di trú tương đối của chúng trên jel CHEF, với dải di trú chậm nhất có số nhiễm sắc thể 1 và nhanh nhất có số nhiễm sắc thể 6. Một số nhiễm sắc rhể di trú trùng hợp nhau trong khi điện di (được chỉ định 2a, 2b, và 2c). Phân tích lai tạo jel CHEF cho biết là các dòng bố mẹ khác nhau bởi một chuyển đoạn ngược (reciprocal translocation) liên quan đến các nhiễm sắc thể 1 và 6 trên 4224-7-8 và 1 và 2c trên 6043 (*)chỉ nhóm dấu không có tái tổ hợp. c (Trang 122)

Nhân giống vô tính PWL2 và phân tích các biến đổi có độc tố

James Sweigard và Anne Carroll nhân giống vô tính PWL2 bằng đường đi của nhiễm sắc thể bắt đầu với một dấu cơ học liên kết, cos222 (Hình 7.5); J.A. Sweigard, A.M.Caroll, P.G. Chumley và B. Valent, kết quả không công bố). Các dòng vô tính có tính tương đồng với HisIII được nhận dạng trong một thư viện cosmid, cho phép chọn lọc các đoạn gen lớn (khoảng 40 kb) của bộ genome M. grisea. Đường đi khó vì tất cả cosmids có tính đồng dạng Cos222 chứa một hay nhiều hơn các chuỗi DNA lập lại ở giữa khác nhau gồm có một chuỗi không nhận dạng trước, MGR768. Các cố gắng để phân lập các cuỗi sao chép đơn để sử dụng như là con dò lai tạo để nhận dạng các các dòng vô tính cosmid gối phụ không thành công. Dòng vô tính sao chép đơn được xác định sẽ là các chuỗi sao chép thấp hiện diện tại các vị trí 4-6 không liên kết trên bộ genome M. grisea. Một thí dụ được trình bày trong Hình 7.6, trong đó một đoạn gen sao chép thấp từ một cosmid liên kết với PWL2 được sử dụng như là một con dò lai tạo chống lại DNA của bộ genome từ bố mẹ và biến đổi nhận khả năng lây lan trên weeping lovegrass (Xem hình 7.4 trên). Sáu dải giống nhau được phát hiện. Dải lớn thứ ba ( “dải 3”) được gắn kết với  PWL2 trên quần thể đang vẽ bản đồ RFLP, và đoạn gen này đang trộn lẫn với tất cả các biến đổi. Một cách thích thú, Dải 2 (mờ) được vẽ gần gen Avr1 -MARA trên nhóm liên kết 2b, và Dải 5 được liên kết với gen AVR2 -YAMO. Các chuỗi sao chép khác cho thấy một xu thế giống nhau để vẽ bản đồ gần các gen AVR và các vùng đầu cuối, dù cho các vùng khác nhau  của bộ genome được nhận dạng. Như là một hậu quả của việc sử dụng các con dò sao chép thấp, nỗ lực đường đi của nhiễm sắc thể (chromosome walking) thật ra là “sự lang thang của nhiễm sắc thể” (chromosome wandering) trong bốn hay năm vùng của bộ genome cùng một lúc. Tuy nhiên, Sweigard và Caroll đã nhận dạng cosmids với các đặc tính mong muốn đối với dòng vô tính PWL2. Có nghĩa là, sự biến đổi của một dòng phát sinh bệnh trên weeping lovegrass đã tạo ra các biến đổi không còn khả năng lây lan trên cỏ weeping lovegrass (Hình 7.1a). Kết quả này đã chứng minh rõ là sự hiện diện của một gen PWL2 hoạt động ngăn cản sự lây lan trên cỏ weeping lovegrass bởi một tác nhân gây bệnh có độc tố trước.

Phân tích thêm, gồm có nghiên cứu một biến đổi điểm pwl2 ^-, đã xác nhận là gen PWL2 mã một polypeptide giàu glycine chứa 145 amino acids. Protein được mã bởi gen PWL2 không tương đồng có ý nghĩa với proteins trong cơ sở dữ liệu chuỗi.  Một peptide tín hiệu giả định là protein có thể được tiết ra. Tuy nhiên, hoạt động sinh hoá của protein này vẫn sẽ là được xác định.

Các kết quả giống như kết quả được trình bày trong Hình 7.6 cho thấy là biến đổi tần số cao tự phát của gen PWL2 là do sự mất đoạn. Các kiểu biến đổi khác, như là biến đổi với chuyên tính đã thay đổi về phía Yashiro -mochi, không cho thấy sự mất đoạn trong vùng PWL2. Tất cả các biến đổi pwl2 ^- được thí nghiệm đến nay đã làm mất đoạn gen PWL2 và ít nhất 30kb  cuae chuỗi DNA cắt ở sườn. Hai hay ba kiểu mất đoạn riêng biệt đã được tìm ra. Do đó, tính bất ổn định tại lô cút PWL2 trên các dòng đang nghiên cứu giống như tính ổn định của lô cút BUF1 không ổn định. Chỉ một alen pwl2 có độc tố không phải là một mất đoạn đến từ bố mẹ vẽ bản đồ RFLP lây lan trên weeping lovegrass, 4224-7-8. Alen này có một thay đổi bp đơn trên chuỗi mã protein, qui đổi một chất tồn lưu aspartic acid thành asparagine.

Hình 7.6  Mất hoạt động của PWL2 được gắn kết với sự mất đoạn (deletion) của chuỗi genome. Sự phân tích Southern được thực hiện trên DNAs của bộ genome từ bố mẹ và các biến đổi (xem Hình 7.4) nhận khả năng lây lan weeping lovegrass. Các phương pháp như được mô tả trong phần ghi chú của Hình 7.2, ngoại trừ là DNAs được tiêu hóa với EcoRI, và vết thấm được lai với một đoan gien EcoRI 7 kb có nhãn bức xạ được phân lập khỏi một cosmid chứa các chuỗi DNA vẽ bản đồ gần PWL2. Các dải có thể được vẽ bản đồ thoái hóa một cách độc lập. Dải lớn nhất thứ ba (mũi tên) cùng thoái hóa với gen PWL2, và điều nói trên đã bị mất đoạn khỏi tất cả các biến đổi gây bệnh tự phát đã thí nghiệm. Các vị trí của chuẩn kích cỡ DNA được đánh dấu tương ứng với năm lớn nhất trong Hình 7.2. (Trang 124)

Nhân giống vô tính AVR2 -YAMO và phân tích các biến đổi

Gen AVR2, ngăn cản lây lan của giống lúa trồng Yashiro -mochi, cùng thoái hóa với một nhóm dấu cơ học ở đầu cuối của một nhóm liên kết (Hình 7.5). Marc Orbach đã phát hiện từ phân tích biến đổi là gen này ở rất gần đỉnh của một nhiễm sắc thể (Hình 7.7; M.J. Orbach, L.Farall. B. Valent, và F.G. Chumley, kết quả không công bố). Các nhiễm sắc thể của các sinh vật thay đổi từ con người đến nấm Neurospora crassa kết thúc với nhiều bản sao của một chuỗi sao chép lập lại oligonucleotide được bảo lưu cao (Blackburn, 1990). Do đó, các đoạn gien giới hạn DNA cuối đoạn có thể được hình dung bằng phương pháp phân tích Southern có sử dụng nucleotide tổng hợp phụ cho chuỗi sao chép cuối đoạn được bảo lưu như là một con dò lai tạo. Orbach đã phát hiện các biến đổi tự phát đã trở thành có độc tố trên giống lúa trồng Yashiro -mochi cho biết những thay đổi cấu trúc trên các đoạn gien giới  hạn cuối đoạn được vẽ bản đồ với AVR2 -YAMO. Trên tám trong 11 biến dổi tự phát được phân lập độc lập, mất biểu hiện AVR2 -YAMO có tương quan với sự biến mất của đoạn gien DNA cuối đoạn đã liên kết. Trong một số trường hợp, các đoạn gien cuối đoạn mới được phát hiện. Sự phân tích các biến đổi CP917 và CP984 và các dòng bố mẹ của chúng đã nhận dạng các đoạn gen giới hạn cuối đoạn đã liên kết (Hình 7.7a) được tạo ra bởi một số endonucleaza. Phân tích này dẫn đến giả thuyết là AVR2 -YAMO ở gần đầu cuối của nhóm liên kết 1/2c, rõ trong 1-2 kb  của ngọn (đỉnh). Giả thuyết này được thí nghiệm bằng cách nhân giống vô tính một đoạn gien cuối 6,5 kb Bg/II DNA. Khi đoạn gen vô tính được đưa vào trong một tác nhân gây bệnh có khả năng lây lan Yashiro -mochi, các biến đổi đặc biệt mất đi khả năng lây lan Yashiro -mochi (Hình 7.1a), chứng tỏ là đoạn gen DNA này có chứa gen AVR2 -YAMO. Lại dự báo tính trội của kiểu hình không độc tố được sinh ra.

Gen AVR2-YAMO mã một protein giả định có chứa 223 amino acids. Chuỗi amino acid cơ bản của protein này thiếu tính tương đồng có ý nghĩa với các protein đã biết khác. Gen ở hoàn toàn trong 1, 5 kb của đỉnh nhiễm sắc thể trên các dòng đang nghiên cứu ở đây. Không giống như biến cố mất đoạn tương đối đồng nhất xảy ra tại các lô cút BUF1 vf PWL2 không ổn định, một số lớn các biến cố di truyền dẫn đến sự không hoạt động của gen AVR2 -YAMO. CP917 có một mất đoạn khoảng 300 bp và CP984 có một mất đoạn khoảng 12 kb. Hình 7.7b tóm tắt một số biến cố trên một họ chuyên tính dòng dõi. Phân tích của 8 biến đổi độc lập từ dòng 4375-R-6 đã phát hiện hai có biến đổi điểm, một với đoạn gen chèn và năm với mất đoạn. Các mất đoạn thay đổi về kích cỡ từ khoảng 100 bp đến trên 12, 5 kb. Kiểu không ổn định này có đặc trưng của vùng cuối đoạn trên các sinh vật khác (Horowitz et al., 1984).

Hình 7.7  (a) Phân tích biến đổi đề xuất AVR2 -YAMO ở đỉnh của một nhiễm sắc thể. Bằng cách sử dụng phân tích Southern, một con dò oligonucleotide tổng hợp giống như chuỗi sao chép 5’ (AACCCT) 3’ ở các đầu cuối của các nhiễm sắc thể nhận dạng các doạn gen giới hạn cuối của bố mẹ không độc tố tương ứng với dầu cuối gắn với AVR2-YAMO.  Kích cỡ của các đoạn gen cuối của bố mẹ không độc tố và biến đổi có độc tố CP917 (Hình 7.4) được vễ sơ đồ. Đối với tất cả enzim giới hạn được sử dụng trong phân tích này, đoạn gien cuối đối với CP917 là khoảng 300 bp nhỏ hơn đoạn gien tương ứng từ bố mẹ không độc tố.  Điều này gợi ý là một mất đoạn trong vòng 700 bp của cuối nhiễm sắc thể tương quan với thiệt hại chức năng của gen AVR2 -YAMO. Đối với tất cả các enzim giới hạn đã thí nghiệm, biến đổi CP984 (Hình 7.4) đã mất đoạn gien cuối gắn kết với AVR2 -YAMO và không nhận được đoạn gien mới. (b) Nhiều biến cố dẫn đến sự nhận tính có độc tố về phía giống lúa trồng Yashiro -mochi. Biểu hiện sơ đồ của các biến cố phân tử gắn kết với sự mất hoạt động của AVR2 -YAMO trên tám biến đổi tự phát phát sinh từ dòng 4375-R-6. CP1615 và CP1635 chứa các thay đổi bp đơn (*)trên chuỗi mã của gen. CP983 t (Hình 7.4) đã mất đoạn nhỏ xa tâm của gen, và CP1632 chứa một đoạn gen chèn của khoảng 1,5 kb (tam giác). Các biến đổi khác có những mất đoạn thay đổi về kích cỡ từ 6, 5kb đến 9kb đế các mất đoạn lớn hơn có kích cỡ không xác định. (Trang 125)

Các chuỗi giống nhau từ các tác nhân gây bệnh của hoà bản khác

Việc nhân giống vô tính gen AVR cho phép Seoghan Kang nghiên cứu sự phân bố của các chuỗi giống nhau trên các dòng M. grisea khác nhau về chuyên tính ký chủ (Hình 7.8; S. Kang và B. Valent, kết quả không công bố). AVR2-YAMO và PWL2 lần đầu tiên được nhận dạng tên các chủng ngoài đồng lây lan trên cây lúa, và hầu hết các tác nhân gây bệnh cây lúa chứa các chuỗi rất giống như cả hai gen. Một cách thích thú, tác nhân gây bệnh trên Digitaria điển hình chứa các chuỗi của bộ genome rất giống với PWL2, và nhiều còn có các chuỗi rất giống với AVR2 -YAMO. Tác nhân gây bệnh trên Eleusine điển hình thiếu sự giống nhau so với cả hai gen AVR vô tính, nhưng nhiều có các chuỗi ít giống với một hay cả hai gen. Bảng 7.3 tóm tắt kết quả nghiên cứu lại tạo trên các dòng trong Hình 7.8 với cả hai con dò của gen AVR. Hình như ngạc nhiên là các tác nhân gây bệnh trên Digitaria chứa các gen AVR cùng với các tác nhân gây bệnh trên lúa trong khi các tác nhân gây bệnh trên Eleusine thì không. Nhiều nghiên cứu đề xuất là quan hệ giữa các tác nhân gây bệnh trên lúa và các tác nhân gây bệnh trên Digitaria gần nhiều hơn với quan hệ giữa các tác nhân gây bệnh trên lúa và các tác nhan gây bệnh trên Digitaria (A. Kubelik; J.A. Sweigard; F.G. Chumley, và B. Valent, kết quả không công bố; M.H. Lebrun, trường đại học Paris, thư riêng, Chương 5, sách này.

Kang đã dự báo là các chuỗi của bộ genome trên tác nhân gây bệnh trên Eleusine WGG -FA40 ít giống với PWL2 (Hình 7.8 luồng 13) có thể là gen PWL1. ông nhân giống vô tính chuỗi giống nhau từ một thư viện gen và đã chứng minh bằng phân tích RFLP cùng thoái hóa với gen PWL1 trên các cặp lai di truyền. Chuỗi vô tính từ WGG -FA40 hoạt động trong việc biến đổi một tác nhân gây bệnh của weeping lovegrass thành không phải là một tác nhân gây bệnh, xác nhận sự hiện diện của PWL1. Các phân tích kế tiếp đã cho phép sự nhận dạng vùng mã PWL1. Chuỗi amino acid của protein PWL1 giả định cho biết 85% giống nhau và 74% giống như chuỗi amino acid của protein PWL2. Các thể đồng nhất hoạt động của PWL2 còn được nhân giống vô tính từ các tác nhân gây bệnh trên Pennisetum.

Các thể đồng nhất hoạt động của ACR2 -YAMO đã được nhân giống vô tính từ các tác nhân gây bệnh trên Digitaria và từ các tác nhân gây bệnh trên Pennisetum (S. Kang và B. Valent, kết quả không công bố). Do đó, dự báo di truyền là các tác nhân gây bệnh trên cây hòa bản khác lúa chứa các gen AVR mang chuyên tính về phía giống lúa trồng đặc biệt (Yaegashi và Asaga, 1981; Valent et al. 1991) đã được chứng minh.

Hình 7.8  Sự phân bố chuỗi giống nhau so với PWL2. DNAs của bộ genome của 34 chủng ngoài đồng là đối tượng phân tích Southern như được trình bày trong bảng chỉ dẫn ở hình 7.2, trừ trường hợp là DNAs được tiêu hóa với EcoRI, và gen PWL2 được sử dụng như là một con dò. Chuyên tính ký chủ của các chủng ngoài đồng được trình bày trong Bảng 7.3. Các dòng có tính tương đồng mạnh gồm có trong các tác nhân gây bệnh trên lúa (các luồng 1-4), một tác nhân gây bệnh trên lúa đại mạch (barley) (luồng 5), một tác nhân gây bệnh trên bắp (maize) (luồng 12), một tác nhân gây bệnh trên Paspalum (luồng 18), bốn tác nhân gây bệnh trên Digitaria (các luồng 23-26) và một tác nhân gây bệnh trên Pennisetum (luồng 30). Bảng 7.3 tóm tắt các dòng có tính tương đồng mạnh với AVR2 -YAMO và so chúng với các kết quả được trình bày ở đây. Tác nhân gây bệnh trên Eleusine WGG-FA40 (luồng 13), cho biết sự tương đồng yếu trên hai dải, chuyển sang sẽ là gắn kết với gen PWL1. Gen PWL1, vô tính từ một thư viện gen WGG -FA40 khai thác tính tương đồng giới hạn này với PWL2, có một điểm EcoRI trên nó, giải trình hai dải trên luồng 13. (Trang 127)

Bảng 7.3  Các tương đồng gen AVR trên các chủng ngoài đồng có chuyên tính ký chủ khác nhau.

^a Một dấu (+)cho biết sự tương đồng mạnh. Một dấu c (+/-)cho biết sự tương đồng trung gian. Sự tương đồng yếu không chỉ định.c

^b  Tóm tắt số liệu trong Hình 7.8.

Bệnh cháy lá trên lúa mì tại Braxin

Một trong các đặc tính được nhận biết đầu tiên của chuỗi DNA sao chép ở giữa MGR586 là sự hiện diện của nó trong 45-50  bản sao mỗi bộ genome của tác nhân gay bệnh trên lúa, nhưng chỉ trong 1-3 bản sao mỗi bộ genome trên các tác nhân gây bệnh của các cây hoà bản khác Hamer et al. 1989). Lợi ích của MGR586 và các con dò DNA khác chuyên tính với các lớp đặc biệt của tác nhân gây bệnh được minh hoạ bởi câu trả lời nhanh và rõ là sự sử dụng MGR586 cho các câu hỏi liên quan đến xuất xứ của bệnh cháy lá trên lúa mì tại Braxin. Bệnh cháy lá do M. grisea trở tành một bài toán nghiêm trọng đối với nông dân trồng lúa mì tại Braxin trong giữa thập niên 1980. Vì bệnh cháy lá trên lúa mì lần đầu tiên xuất hiện tại bang Parana, một cùng chuyên canh lúa ở đó bệnh cháy lá là quan trọng, hình như có thể là nấm gây bệnh cháy lá lúa đã biến đổi để ký sinh trên lúa mì. MGR586 được sử dụng để tạo ra dấu tay DNA của các tác nhân gây bệnh trên cây lúa và các tác nhân gây bệnh trên lúa mì Braxin. Kết quả đã chứng minh rõ  là các tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì Braxin không phát sinh từ các tác nhân gây bệnh trên lúa bản địa đến vùng (Hình 7.9); F.G. Chumley, L. Farall, và B. Valent, các kết quả không công bố). Các tác nhân gây bệnh trên lúa Braxin giống như các tác nhân gây bệnh trên lúa thu thập từ các vùng khác nhau trên thế giới có nhiều bản sao của chuỗi MGR. Ngược lại, các tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì biểu hiện các dấu tay điển hình của các tác nhân gây bệnh của hoà bản khác hơn là cây lúa, chứa rất ít dải có tương đồng chuỗi MGR.

Hình 7.9  In MGR586 chứng minh là các tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì tại Braxin không phát sinh từ các tác nhân gây bệnh trên cây lúa. Phân tích Southern được thực hiện như được trình bày trong bảng chỉ dẫn trong Hình 7.2, trừ trường hợp là DNAs của bộ genome được tiêu hoá với EcoRI, và điểm thấm được lai với các chuỗi MGR586 có nhãn bức xạ. Từ trái sang phải, các dòng 4091-5-8, một tác nhân gây bệnh trên weeping lovegrass; O-282 và O -283, tác nhân gây bệnh trên cây lúa Braxin; G-155, G-157 tác nhân gây bệnh trên hoà bản Braxin; T-1, T-7 tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì Braxin; và O -137 tác nhân gây bệnh trên cây lúa Trung quốc. Các dòng O -282, O-283, G-155 (từ Rhynchelytrum roseum), G-156 (từ Digitaria horizontalis) và G -157 (từ Triticale hoang dã) và một số các tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì được thí nghiệm nhận được từ Dr. A.S. Prabhu (EMBRAPA/CNPAF, Braxin). Các tác nhân gây bệnh trên cây lúa mì khác nhận được từ Dr. S. Igarashi của Viện Nông nghiệp Parana, Braxin). Các tiêu chuẩn kích cỡ được đánh dấu như được trình bày trong Hình 7.2. (Trang 130).

Tóm tắt và kết luận

Việc nhân giống vô tính nhiểu gen chuyên tính ký chủ từ M. grisea đã tạo ra cách nhìn rõ tính chất phân tử của một hệ thống nhận biết phức tạp điều khiển chuyên tính ký chủ trên bệnh cháy lá lúa. Như trong các tác nhân gây bệnh thực vật do khuẩn (Kobayashi et al. 1989). Các gen AVR tương ứng với các giống lúa trồng đặc biệt hình như sẽ là phổ biến trên các tác nhân gây bệnh M. grisea trên lúa hay các hoà bản khác.  Giả thuyết làm việc đã là sản phẩm của một gen AVR thuộc nấm tương tác, trực tiếp hay gián tiếp, với sản phẩm của một gen kháng trên cây trồng. Sự tương tác này kích hoạt phản ứng bảo vệ trên cây trồng ngăn cản lây lan do nấm. Cac gen AVR gây bệnh chấy lá vô tính đầu tiên xác định một đặc tính chính của giả thuyết này, tính trội của các gen AVR. Có nghĩa là, tính không độc tố phát sinh từ sự hiện diện của sản phẩm gen của một gen AVR hoạt động. Một cách thích thú, các gen giống nhau điều khiển khả năng của nấm để lây lan một loài ký chủ thứ hai, weeping lovegrass (Eragrostis curvula). Chúng tôi tham khảo các “gen  chuyên tính ký chủ“này, PWL1 và PWL2, như là các gen AVR vì kiểu hoạt động của chúng hình như sẽ là giống với kiểu hoạt động của các gen AVR cổ điển.

Rõ là, các gen AVR trên tác nhân gây bệnh không tiến hoá để ngăn cản tác nhân gây bệnh khỏi lây lan các kiểu gen khác nhau của ký chủ của nó. Thay vì, hẳn là cây trồng có nhận khả năng để nhận biết các phân tử của tác nhân gây bệnh với các hoạt động khác nhau. Việc xác định điều gì là các hoạt động này có thể cho đầu mối như theo đó các gen kháng có thể là bền. Thí dụ, một gen kháng ở trên một gen AVR nấm cần sẽ là cạnh tranh có thể là khó đối với nấm thâm nhập. Rõ là co các dòng của tác nhân gây bệnh ngoài đồng không chứa các gen AVR mà chúng ta đã nhận dạng, chưng minh là chúng không cần sống sót ở ngoài đồng. Không phải là protein PWL2 cũng không phải là protein AVR2 -YAMO có tương đồng chuỗi amino acid cơ bản có ý nghĩa với các protein có hoạt động đã biết. Do đó, các chuỗi này không cung cấp ngay các đầu mối cho hoạt động của các gen này. Các kháng thể chống lại protein AVR nay có thể được sử dụng để định vị tế bào của các proteins trên các mô thực vật lây nhiễm nấm, có thể tạo ra một đầu mối cho hoạt động của chúng. Các nghiên cứu tế bào là cần để nhận dạng phản ứng của tế bào có tương quan với hoạt động của từng gen AVR. Heath et al. (1990) đã báo cáo các cố gắng đầu tiên về việc nhân dạng một (nhiều) đặc tính tế bào bị ảnh hưởng bởi PWL1 trên các dòng bố mẹ và hai thể tứ trọn vẹn. Tính phát sinh bệnh và tính không phát sinh bệnh có tương quan tốt với sự vắng mặt hay hiện diện, tương ứng, của các tế bào