Cấu trúc ba chiều của virus gây bệnh lúa lùn được xác định ở độ phân giải 6.8  bằng phương pháp kính hiển vi lạnh điện tử hạt đơn. Bằng cách hội nhập phân tích cấu trúc với tin sinh học, những nhóm protein trong dạng quả nang hai vỏ được phát sinh. Trong protein vỏ ngoài, những miền cao và thấp có định hướng độc nhất gồm có những yếu tố cấu trúc thứ cấp tương tự nhưng có nhưng phương hướng tương đối khác nhau so với phương hướng của virus lưỡi xanh dương (bluetongue virus) trong cùng họ Reoviridae. Những khác biệt về chuỗi và cấu trúc giữa những protein này có thể là quan trọng trong việc xác định những phản ứng tương hỗ virus-ký chủ. Protein vỏ trong chấp nhận một cấu hình giống như những thành phần khác của Reiviridae, gợi ý một tổ tiên chung đã tiến hóa lây nhiễm sinh vật ký chủ thay đổi từ thực vật sang động vật. Sự không tương thích đối xứng giữa hai phản ứng tương hỗ góp phần vào tính ổn định của cỗ máy phân tử lớn lớn.

Virus lúa lùn (RDV) là một mầm bệnh chủ yếu của cây lúa ở Đông Nam Á, nơi mà sự lan truyền RDV có thể co những hậu quả kinh tế nghiêm trọng. RDV, thuộc về Reoviridae, được lan truyền bởi rầy xanh Nephotettix cincticeps sang những loài cây dễ nhiễm, việc lập lại trên ký chủ và vectơ. Virus trong Reoviridae, mà ký chủ gồm có thực vật, côn trùng và động vật, chia sẻ một cơ chế chung lập lại^1,2 nhưng thay đổi về mặt thực chất trong tổ chức³ cấu trúc của chúng. RDV, một hạt vỏ kép có 12 đoạn dsRNA, có một khối lượng protein tổng số >26 MDA. Những cố gắng trước đây trong việc khảo nghiệm RDV bằng phương pháp kính hiển vị lạnh điện tử ở độ phân giải thấp đã trình bày tổ chức^4-7. Vỏ dạng nang ngoài có 260 trimers (chất tam phân) của P8 (46kDa) sắp xếp trên một T= 13/thể thức lô phụ 20 mặt (icosahedral lattice). Vỏ dạng nang trong gồm có 60 dimers (chất nhị phân) của P3 (114 kDa) sắp xếp trên một T= 1 thể thức lô phụ 20 mặt. Mặc dù tổ chức dạng nang này cùng là một tổ chức của những hạt vỏ kép của vài thành phần khác của Reoviridae, tính đồng dạng chuỗi với P3 và P8 không ý nghĩa (đồng dạng <20%)⁴.

Cấu trúc tổng hợp

Với những hoàn chỉnh mới trong việc nhận và xử lý những ảnh kính hiển vi lạnh điện tử, trong việc xác đinh cấu trúc RDV đến một độ phân giải cao có ý nghĩa đã trở thành có thể thực hiện, Việc hội nhập phân tích chuỗi và công cụ tính toán⁹ đã cho phép chúng tôi nhận diện những yếu tố cấu trúc thứ cấp của P3 cà P8 và, vì thế, xây dựng một mô hình cấu trúc trong thể dạng nang RDV vỏ đôi.

Ohor lực trên máy vi tính của một miền đại diện từ một vi ký gần trung tâm (close-to-focus micrograph) của RDV (Hình 1a) có độ đen trắng có thể khám phá vượt quá 6 Ă (Hình 1b). Độ phân giải hiệu quả của tái xây dựng này được đánh giá sẽ là 6.8 Ă (Hình 1c) từ đó những cấu trúc của những vỏ ngoài và trong của thể dạng nang được chia đoạn về mặt tính toán (Hình 1d, e). Mặc dù tổ chức tổng hợp của thể dạng nang (capsid) giống như tổ chức của hạt có khả năng dịch mã của virus lưỡi xanh (bluetongue) (BTV)¹⁰ và reovirus¹¹ động vật, gình tròn, RDV có góc riêng biệt

Thể dạng nang ngoài và mô hình P8

Vỏ ngoài của mỗi thể dạng nang RDV được tạo thành năm chất tam phân (trimers) độc nhất (P, Q, R, S và T) (Hình 1d) của protein P8 tổ chức trên một T = 13Ɩ thể thức lô phụ 20 mặt. Mặc dù chỉ có chất tam phân T có tính đối xứng ba nhóm 20 mặt bắt buộc trong suốt thời kỳ xây dựng lại, tất cả năm chất tam phân khác xuất hiện rất giống lẫn nhau.

Ngoài ra, tất cả những chất tam phân có quan hệ tương hỗ tốt với chất nọ chất kia và trình bày một mức độ cao tính đối xứng ba nhóm với một hệ số quan hệ tương hỗ >0,85. Vì thế, để cải thiện tỷ lệ tín hiệu - đối - tiếng động, và những chất tam phân P, Q. R và S được đặt trên một đường thẳng và tính toán trung bình. Chất tam phân trung bình là 70 Å cao và 70  đường kính, với một đơn vị phụ đơn phân (monomeric subunit) gồm có một miền cao và thấp xoắn 60^o với nhau khoảng trục 3-nhóm (Hình 2a). Miền cao của mỗi đơn vị phụ P8 cơ bản có những tỷ trọng mỏng, phẳng, và cạnh nhau, nhưng trái lại miền thấp chủ yếu gồm có những tỷ trọng dạng que (Hình 2b). Việc sử dụng HELIXHUNTER⁹. Chúng tôi đã nhận diện và đặt chín vòng xoắn (helices) ơt miền thấp P8 (Hình 2c). Để nhận diện những chuỗi amino acid tương ứng với những vòng xoắn này, chúng tôi xác định quan hệ tương hỗ những điểm không gian tương đối và độ dài những đoạn xoắn của chúng với những điểm dự báo từ phương pháp dự báo cấu trúc thứ cấp bội (PsiPred¹². PHD¹³ và SSPRO¹⁴).

Mặc dù những điểm của chín vòng xoắn liên ứng đx nhận diện bởi phương pháp dự báo thứ cấp trong chuỗi P8 (Bảng 1) không thay đổi, độ dài chính xác của những vòng xoắn dự báo thay đổi đến bẩy độ dài tồn lưu. Việc chỉ định chuỗi cho những vòng xoắn giả định từ phân tích HELIXHUNTER (Bảng 1) được đề xuất dựa trên sự tương thích độ dài vòng xoắn và tính liên tục của tỷ trọng khối lượng giữa vòng xoắn chuỗi ở những mức độ diễn biến khác nhau (Hình 2e). Ở đầu N, năm vòng xoắn (1-5) và những điểm nối của chúng có thể được chỉ định.

Tuy nhiên, trên những vòng xoắn đầu C, những tỷ trọng khối lượng của chỉ những vòng xoắn 6, 7 và 9 là cạnh nhau. Vòng xoắn 8 không được chỉ định, vì nó pphân giải tồi trên chuỗi và cũng như cấu trúc không nối với tỷ trọng ở miền đầu C. Việc chỉ định vòng xoắn này được hỗ trợ thêm bởi sự tương thích thứ tự trên chuỗi đến thứ tự của vòng xoắn trên VP7 protein dạng nang ngoài BTV, như được đánh giá bởi hai phương pháp dùng phổ biến của việc so sánh những cấu trúc proteins^{9, 15.16}. Ví dụ, sáu trong những vòng xoắn ở RDV P8 (những vòng xoắn 1, 2, 4, 6, 7 và 9) tương thích tốt, với độ lệch <5 Å (r.m.s) bình phương trung bình căn dựa trên những dạng trung tâm vòng xoắn (helical centroids), với những vòng xoắn tương ứng ở BTV VP7 (Bảng 1). Những vòng xoắn đầu N hình như rõ nét là tương thích với vòng xoắn BTV tương ứng tốt nhiều hơn những vòng xoắn đầu C, gợi ý là một di chuyển miền liên quan những miền đầu N và đầu C.

Những phương pháp dự báo cấu trúc thứ cấp còn cho biết là miền giữa của chuỗi P8 (128-135) có những sợi b. Tuy nhiên, tính biến đổi của dự báo trong miền này cao rất nhiều so với những miền đầu giàu vòng xoắn. Việc nhận biết nhóm17, miền này được dự báo sẽ là đồng nhất về mặt cấu trúc với miền bánh kẹp (sandwich) b của BTV VP7 (tham khảo 4). Mặc dầu sợi b cá thể không thể phận giải được trên bản đồ 6,8 Å,những hình dạng phẳng, liên tục trong miền trên thể hiện những đặc tính điển hình của những tấm b ở độ phân giải này (Hình 2b), Việc dùng FOLDHUNTER9, nhóm bánh kẹp b đồng nhất được đặt vào miền trên của đơn vị phụ RDV P8 (Hình 2d). Mặc dù sự rương thích tổng hợp hình như là hợp lý, một trường hợp không tương thích rõ nét ở phần ngoài cùng của miền trên P8 có thể được vẽ nản đồ lại mộtt khác biệt tương ứng giữa miền tấm b của RDV P8 và những chuỗi⁴ protein BTV VP7. Khác biệt cấu trúc này trong miền ngoài cùng của P8 gợi ý một liên quan có thể thực hiện trong việc nhận biết thể nhận tế bào ký chủ đặc biệt, đính kèm và/hoặc lối vào.

Từ việc phân tích chuỗi và cấu trúc, chúng tôi đề nghị một mô hình nhóm (fold model) cho RDV P8 (Hình 2e). Mặc dù việc đặt những sợi và tính liên kết của chúng trong miền trên có tính chất suy đoán, nhóm của miền xoắn thấp được chứng minh bởi những vòng xoắn phân giải tốt, tính liên kết của chúng rõ nét ở một diễn biến tỷ trọng thấp, phù hợp với dự báo cấu trúc thứ cấp trên nền chuỗi và tương thích với những yếu tố cấu trúc tương ứng từ BTV VP7 (Bảng 1). Mặc dầu cấu trúc miền hai của P8 giống nhau với cấu trúc VP7 của BTV, phương hướng tương đối của những miền này khác nhau so với đồng dạng cấu trúc của VP7: REF và HEX, hiện có hai dạng tinh thể^{18, 19} khác nhau. P8 hình như sẽ là trong một cấu hình ít xoắn (60^o) giữa những miền cao và thấp so với đồng dạng REF (120^o) nhưng nhiều hơn so với đồng dạng HEX (O^o) của VP7. Khác biệt này có thể bị ảnh hưởng bới những biến đổi trên những đoạn linh hoạt trong miền bản lề (dấu hoa thị, Hình 2e). Ngoài ra, sự sắp xếp đơn vị phụ đưa đến miệng của hình thức đường hầm trên đỉnh của chất tam phân, ngược lại với tỷ trọng đầy hoàn toàn trên bề mặt đỉnh của chất tam phân tương ứng của BTV. Cấu hình độc nhất này có thể làm dễ dàng phản ứng tương hỗ đơn vị phụ cần cho tính ổn định của dạng nang trong khi duy trì bề mặt tiên quyết của phản ứng tương hỗ thể nhận ký chủ.

Dạng nang trong và mô hình P3

Nằm dưới những chất tam phân của vỏ ngoài là những chất nhị phân 60 P3 tạo ra T = 1 vỏ trong (Hình 1e). Những cấu trúc của đơn vị phụ A và B của chất nhị phân P3 trên RDV được chia đoạn trên biểu đồ từ dạng nang trong. P3 A và B cần có hai chiều (planar), dài 150 Å và dày 25-35 Å, có một hình thức lưỡi liềm tổng hợp. P3 có thể được chia ra thành ba miền, miền tham khảo như đỉnh (gần trục nhóm năm), miền mai (dạng đĩa) và miền chất nhị phân hóa (gần trục nhóm hai) trên BTV10. Một tính đồng dạng thô với proteins dạng nang trong reovirus khác là rõ nét.

Việc sử dụng HELIXHUNTER9, 28 vòng xoắn trong mỗi đơn vị phụ trong một máy không đối xứng của vỏ trong được nhận diện (Hình 3a, b). Tuy nhiên, những độ dài và vị trí đúng cửanhngx vòng xoắn tương ứng trên P3A và P3B hơi thay đổi, phản ánh biến đổi cấu hình giữa những đơn vị phụ như còn thấy trên reovirus BTV và  động vật. Như với P8,  ba phương pháp dự báo cấu trúc thứ cấp đã trình bày cho những điểm chuỗ và độ dài tương tự của vòng xoắn đã dự báo (Hình 3g). Những vòng xoắn dự báo chuỗi sau đó có quan hệ tương hỗ với những vòng xoắn đã thấy trong cấu trúc của chúng tôi như đã trình bày trong P8 (Hình 3a,b). Ngoài ra, bốn tấm b thấy rõ nét trong miền chất nhị phân hóa của cả hai đơn vị phụ như trong miền carapace (mai) của đơn vị phụ A.

Một tính đồng dạng tổng hợp giữa sự sắp xếp yếu tố cấu trúc thứ cấp trong đơn vị phụ P3A và P3B với những đơn vị phụ tương ứng BTV10 và lõi 11 reovirus động vật là rõ nét và, vì thế, làm dễ dàng cho việc liên kết những yếu tố cấu trúc đã quan trắc (Hình 3c,d). Ngoài ra, tính liên kết của những vòng xoắn rõ nét trong bản đồ của chúng tôi (Hình 3f). Tính liên kết đề xuất (đường đỏ, hình 3c,d) giữa những vòng xoắn, dựa trên proteins lõi reovirus BTV và động vật, phù hợp với tỷ trọng đã quan trắc trong bản đồ của chúng tôi, nhưng trái lại những mối liên kết của sợi b (đường chấm đỏ, hình 3c,d) không được phân giải tốt và vì thế, có tính chất suy doán nhiều hơn.

Những khác biệt đã quan trắc trong sắp xếp không gian chi tiết của những yếu tố cấu truc thứ cấp giữa P3A và P3B có thể có liên quan với những vai trò chức năng và cấu trúc khác nhau của chúng, Những miền đỉnh của P3 A và B, mặc dù rất giống nhau, thể hiện những khác biệt trong một dải ba vòng xoắn ngắn (những vòng xoắn 13-15).

Những vòng xoắn này trên P3A hình như sẽ là thứ tự tốt và đặt gần trục năm nhóm. Tuy nhiên, những vòng xoắn tương ứng trên P3B ít được phân giải. Việc chia nhóm của những miền vòng xoắn có thể thay đổi P3A này khoảng trục nhóm năm đưa đến hình thành một khổng dọc trục này (Hình 1e). Vì thế, những vòng xoắn này có thể có liên quan trong dịch mã mRNA mới sinh và đẩy ra trong quá trình lập lại vi rút, một quá trình chung trong số những virus dsRNA xuất hiện gần trục nhóm năm^2,20,21. Tính linh hoạt đội hình của những vòng xoắn này có thể cho phép một cách tin được trong việc phát triển và/hoặc co rút không cần trong và sau khi thả mRNA.

Giống như những vòng xoắn ở miền đỉnh, những vòng xoắn ở miền mai (carapace) đã được quan trắc tốt giữa P3A và P3B. Tuy nhiên, có một khác biệt rõ trong một miền (carapace) bao gồm trong khi tiếp xúc đơn vị phụ (intersubunit). Trên P3B, một vòng xoắn dài 30 Å (vòng xoắn 1), còn thấy trong một điểm tương đương trong reovirus¹¹ động vật, nhô ra khỏi lưng miền mai. Trên P3B, vòng xoắn này chèn vào một túi hìnhthành bởi những vòng xoắn 22-25 của P3A (Hình 1e. 3c,d) nhưng không thấy rõ trong điểm tương ứng ở P3A, giống như cả hai proteins dang nang trong tương ứng của BTV và lõi reovirus động vật.

Những miền chất nhị phân hóa có số lượng đồng đạng ít nhất giữa P3A và P3B, và mô hình của chúng tôi gợi ý là cả hai gồm có chủ yếu những vong và tấm b. Việc đóng gói những đơn vị phụ dạng nang trong kết hợp với tính chất linh hoạt tiềm tàng của miền này có thể chịu trách nhiệm về những khác biệt cấu hình.

Không tương thích đối xứng

Như đã trình bày trong những thành phần khác của Reoviridae3, chức năng sơ cấp của vỏ trong lè để bảo vệ RNA và cung cấp những điểm thả neo cho enzymes trong việc làm dễ dàng quá trình dịch mã nội sinh, nhưng trái lại vỏ ngoài trung gian chuyên tính của sinh vật ký chủvà giữ những vai trò quan trọng trong tập hợp dạng nang và tính ổn định. Trong cấu trúc của chúng tôi, không có chất nhị phân P3 cũng không có tam phân P8 có những tiếp xúc rộng trong vở tương ứng của chúng (Hình Id,e). Tuy nhiên, những phản ứng tương hỗ giữa proteins dạng nang trong và ngoài là có thật, vì mỗi chất tam phân dạng nang ngoài tiếp xúc proteins dạng nang trong bội. Những điểm tiếp xúc giữa hai vỏ chủ yếu được đặt vào những vòng xoắn 2 và 3 của P8 nhưng phổ biến nhiều hơn trên P3 (Hình 4). Đặc biệt, chất tam phân P của P8 tạo ra những tiếp xúc độc quyền với những miền đỉnh của P3A và P3B (đỏ, Hình 4c), nhưng trái lại chất tam phân T tạo ra những tiếp xúc với những miền chất nhị phân hóa của ba phân tử P3B lân cận khoản trục nhóm ba (xanh nhạt, hình 4c). Ba chất tam phân còn lại duy trì những điểm tiếp xúc bội với vài phân tử P3A và P3B lân cận (Hình 4b,c). Những điểm tiếp xúc đã nhận diện được bảo toàn qua mọi đơn vị không đối xứng. Những phản ứng tương hỗ không tương đương và chuyên tính cho phép T = 1 vỏ trong và T = 13l vỏ ngoài trong việc duy trì một quan hệ hình học độc nhất và ổn định trong suốt thờikỳ lập lại và thả RNA.

Kết luận

Phân tích của chúng tôi gợi ý những nhóm tổng hợp của những proteins vỏ dạng nang RDV xuất hiện giống nhau trong số những thành phần khác nhau trong cùng một họ3 virus, mặc dầu chúng không có tính đồng nhất chuỗi có ý nghĩa. Đây là một chỉ dấu tiến hóa phân kỳ của những loại virus này từ một tổ tiên chung nhằm để thích ứng với môi trường và ký chủ khác nhau. Bằng cách duy trì một cấu trúc dạng nang giống nhau và cấu trúc protein, những phản ứng tương hỗ đặc biệt cần cho tính ổn định dạng nang có thể được duy trì, nhưng trái lại những khác biệt cấu trúc trong số proteins vỏ ngoài có thể giữ những vai trò chủ yếu trong việc cho chuyên tính ký chủ trong khi lây lan.

Việc xác đinh cấu trúc của RDV cung cấp trình diễn đầu phát sinh từ một mô hình phân giải cao trong những hợp phần phân tử trong một tập hợp lớn không có một tinh thể, thông qua sự hội nhập kính hiển vi lạnh điện tử với công cụ tin sinh học. Chúng tôi cho biết là ở độ phân giải 6,8 Å, mặc dù chỉ những vòng xoắn và tấm b của proteins có thể nhận rõ được, việc thiết lập một mô hình nhóm độ phân giải cao có thể thực thi được. Việc xây dựng những mô hình này thu nhỏ sự hội nhập thông tin, bắc cầu lại việc chỉ định cấu trúc (miền thấp P8), việc đặt miền thông qua sự nhận biết nhóm (miền trên P8) và việc chỉ định nhóm nhờ vào mô hình (P3). Một phương pháp tiếp cận tổng hợp thường là có thể sử dụng cho những cỗ máy sinh học lớn khác.

Phương pháp

Kính hiển vi lạnh điện tử, kính hiển vi lạnh điện tử A. JEOL4000 với một máy giữ lạnh Gatan được dùng để ghi những cặp tiêu cự của RDV tinh chế ở 400keV như đã trình bày⁸. Máy vi ký cá thể được số hóa ở 1.35 Å pixel-1 trên một máy quét SCAI (Z/I Imaging) và kế tiếp trung bình đến 2.7 Å pixel-1. Từ 81 cặp tiêu cự, >4.000 cặp ảnh hạt RDV được chọn để phân tích thêm. Ảnh hạt từ máy vi ký xa-từ-tiêu điểm (far-from-focus micrograpjs) được dùng trong việc xác định những tham số định hướng đầu trong những hạt tương ứng trong vi ký^8,22,23 gần-lại-tiêu diểm. Những tham số định hướng và trung tâm của mỗi hạt gần-lai-tiêu điểm được tinh chế nhiều lần như đã trình bày^23,24. Một hiệu chỉnh hoạt động chuyển giao tương phản với một độ tương phản phóng lớn 7% và yếu tố làm ướt phóng Fourier 100 Å2 được áp dụng cho mối ảnh hạt trước khi 3D hòa lẫn không gian²⁵ iFourrier. Chỉ những ảnh hạt gần lại tiêu điểm, từ 0.3 đến 2.2 mm dưới tiêu điểm, được bao gồm trong xây dựng lại 3D cuối, được tính toán bằng cách hòa lẫn 3,261 hat^25,26. Độ phân giải hiệu quả được xác định với tiêu chuẩn ngưỡng 0,5 trong hệ số quan hệ tương hỗ vỏ Fourrier giữa hai tái xây dựng không phụ thuộc^27.28.

Phân tích cấu trúc

Từ bản đồ tỷ trọng, hơi lớn so với một may không dối xứng được trích về mặt biểu đồ bằng cách sử dụng mô đun tùy chỉnh xây dựng trên IRIS Explorer (NAG). Những định nghĩa giữa proteins dạng nang, cũng như tiếp xúc của chúng, được nhận diện bằng mắt, cho phép những máy phụ riêng về mặt hình học sẽ chia đoạn thêm từ thể dạng nang. Mỗi chất tam phân được đặt trên đường thẳng đến chất tam phân T bằng cách sử dụng FOLDHUNTER9. Trục đối xứng nhóm ba cục bộ trong những chất tam phân được tinh chế nhiều lần và mức độ của đối xứng nhóm ba được đánh giá khoảng trục²⁹. Những chất tam phân đặt thẳng hàng, trừ chất tam phân T, sau đó được cộng lại để tạo ra một chất tam phân trung bình. Một chất đơn phân được trích sau đó từ chất tam phân P8 trung bình. HELIXHUNTER9 sau đó chạy trên mọi máy phụ dạng nang và những chất đơn phân P3 trong việc nhận diện những vòng xoắn tiềm tàng. Hơn nữa, miền tấm b của BTV VP7 bị mờ đến đến độ phân giải €7 Å bằng cách sử dụng PDB2MRC30 và đặt ở RDV P8 bằng cách sử dụng FOLDHUNTER9. Việc dự báo cấu trúc thứ cấp bằng cách sử dụng SSPRO14, PsiPred12 và PHD13 được thực hiện trong P3 (SWISS-PROT ID VP8_RDVF) và P8 (SWISS PROT ID VP3_RDVF). Những kết quả nhận từ HELIXHUNTER9 và những dự báo cấu trúc thứ cấp sau đó có quan hệ tương hỗ để vẽ bản đồ chuỗi đến vòng xoắn đã quan trắc. Việc chỉ định những vòng xoắn dựa trên độ dài, điểm, tính liên tục tỷ trọng và sắp xếp không gian. Trên P3, những cấu trúc của BTV tương ứng và proteins reovirus được dùng để tham khảo trong quá trình xây dựng mô hình. Những mối nối phỏng chừng giữa những miền vòng xoắn và tấm b được chỉ định dựa cơ bản trên tính liên kết đã nhận diện bằng mắt những yếu tố cấu trúc thứ cấp trong bản đồ tỷ trọng của chúng tôi và tính đồng nhất với những cấu trúc BTV và reovirus.

Ngày 25-07-2006