Công nghệ DNA tái tổ hợp và tạo chuỗi DNA cung cấp công cụ để vô tính và mô tả đặc tính gien. Như chúng ta đã hiểu rõ trong chương 8, sự khảo sát giản đơn của chuỗi gien nói với chúng ta về tổ chức genomic. Chuỗi hoạt động, như là các yếu tố kiểm tra sao chép, thường có thể được nhận dạng bằng cách so sánh vài chuỗi gien. Tuy nhiên, để nghiên cứu sâu xa cấu trúc và hoạt động của gien cần có khả năng làm thay đổi chuỗi DNA và khảo sát hiệu ứng thay đổi về hoạt động của gien. Hàng thập niên trước khi xuất hiện DNA tái tổ hợp, điều này được thực hiện bởi di truyền cổ điển, việc nhận dạng sinh vật đột biến có các đặc tính mới. Từ các đặc tính di truyền của đột biến, thông tin về cấu trúc và họat động của gien nằm dưới có thể thường được suy luận. Tuy nhiên, phương pháp tiếp cận này bị giới hạn ở sinh vật trong đó phân tích di truyền giản đơn là có thể - vi sinh, men, ruồi đục quả. Phân tích di truyền phức tạp hơn, sinh vật có đời sống dài hơi, chuột và con người thì chậm và khó.

DNA tái tổ hợp đã thay đổi tất cả điều đó. Khả năng để phân lập gien như các dòng vô tính phân tử, sự phát triển của các công cụ để làm thay đổi chuỗi gen trong ống nghiệm, và sức mạnh để trở lại các gen đã thay đổi thành sinh vật để khảo nghiệm hoạt động của chúng đã cách mạng hóa phương pháp di truyền được thực hiện trên sinh vật cấp cao. Vì chúng ta nay thường làm việc “chậm tiến” (backwards) từ chuỗi gien đến hoạt động gien, ngược lại di truyền cổ điển, phương pháp tiếp cận mới này được tạo ra bởi DNA tái tổ hợp có tên là “di truyền ngược” (reverse genetics). Trong chương này chúng ta sẽ học tập các phương pháp làm thay đổi chuỗi của một gien vô tính theo ý muốn và làm thế nào các phương pháp được sử dụng để hiểu rõ cấu trúc và hoạt động của gien và sản phẩm gien.

Phương pháp tạo mutagen in vitro được sử dụng để khảo sát hoạt động gien

Phương pháp tạo mutagen của gien vô tính đã trở thành một công cụ chuẩn trong phân tích hoạt động nucleic acid và protein. Hầu hết các phương pháp đi theo cùng một khung cơ bản (Hình 11-1). Plasmid DNA chứa gien đang quan tâm được xử lý in vitro bởi một số phương pháp tạo mutagen làm thay đổi DNA hoặc là hóa hay là enzim. Plasmid DNA được mutagen -hóa được đưa vào trong E. coli bằng biến đổi, và các khuẩn lạc chứa các phân tử plasmid được chọn bằng tính kháng chất kháng sinh. Các đột biến có thể thực hiện từng lần một, hoặc hàng trăm đột biến khác nhau có thể được tạo ra trong một khảo nghiệm tạo mutagen đơn. Plasmid đột biến có thể được phân lập từ khuẩn lạc đơn và được khảo nghiệm riêng. Một cách thay đổi, plasmid DNA có thể được chế phẩm từ các khuẩn lạc tập hợp và thư viện kết quả được khảo nghiệm theo khối để nhận dạng plasmid đột biến.

Các phương pháp tiếp cận khác nhau để tạo mutagen có thể được chia nhóm một cách rộng rãi thành các phương pháp ngẫu nhiên và có định hướng vị trí. Các phương pháp ngẫu nhiên đặt đột biến bất kể nơi nào trên một plasmid. Chúng được sử dụng tốt nhất để nhận dạng vị trí và ranh giới của một hoạt động đặc biệt trong một đoạn gien DNA vô tính và được sử dụng dễ nhất cho mục đích này khi một thanh lọc di truyền giản đơn (hay chọn lọc) có thể sử dụng. Một thanh lọc di truyền hoặc chọn lọc gồm có một phương pháp để khảo nghiệm hoạt động của DNA đang quan tâm trên tế bào mà không phải phân lập từng plasmid cá thể. Phương pháp tạo mutagen ngẫu nhiên thường được sử dụng như là một bước đầu, khi ít điều được biết về hoạt động được mã bởi đoạn gien DNA đặc biệt. Việc phân tích các đột biến ngẫu nhiên thường chỉ cung cấp việc nhận dạng giản đơn vùng hoạt động nhưng không giải trình làm thế nào sự việc diễn tiến ở mức phân tử. Giá trị của một phương pháp trên là giúp nhanh thu hẹp trọng tâm của sự chú ý từ một đoạn gien DNA lớn thành vùng nhỏ hơn có thể được khảo sát kế tiếp chi tiết nhiều hơn. Như chúng ta đã hiểu rõ, phương pháp tạo mutagen ngẫu nhiên có thể được hoàn tất bằng một vài phương pháp khác nhau, như là làm thay đổi các chuỗi trên vị trí endonuclease ức chế cắt, chèn một oligonucleotide linker một cách ngẫu nhiên vào một plasmid, gây hại cho plasmid DNA in vitro với hóa chất, hoặc tổng hợp nucleotide không đúng trong khi tổng hợp DNA in vitro.

Khi một lãnh vực hoạt động quan trọng trên một gien đã được nhận dạng bằng tạo mutagen ngẫu nhiên, các phương pháp có định hướng vị trí - đặt các đột biến một cách chính xác ở nơi chúng cần - được sử dụng để xác định vai trò của chuỗi chuyên tính. Ngoài ra, phương pháp tạo mutagen có định hướng cung cấp một công cụ mạnh để phân tích hoạt động protein. Một số phương pháp đã được phát triển để xây dựng các đột biến có định hướng vị trí in vitro, nhưng kiểu tạo mutagen này được hoàn tất tốt nhất bằng cách sử dụng nucleotide tổng hợp. Với một oligonuceotide chuỗi mong muốn được xây dựng giản đơn thành phương pháp kiểu hoang. Nay, các phản ứng tạo mutagen có định hướng oligonucleotide tương đối thẳng (straighforward), và oligonucleotide rẻ tiền và dễ nhận. Giới hạn của tạo mutagen có định hướng vị trí là bạn phải đã có đủ thông tin để hiểu rõ điều bạn muốn thay đổi. Có hai phương pháp chuẩn sử dụng oligonucleotide để xây dựng đột biến có định hướng vị trí: phương pháp tạo mutagen bằng tổng hợp gien và phương pháp tạo mutagen bằng hiển thị enzim của một oligonucleoide đột biến. Bằng cách sử dụng phân ly oligonucleotide (xem chương 7) một bộ đột biến “ngẫu nhiên” ở một vị trí chuyên tính cũng có thể được thực hiện.

Hình 11-1 (trang 192) Phương pháp tổng hợp đối với một khảo nghiệm tạo mutagn. Hầu hết các phương pháp để tạo mutagen in vitro theo cùng một phương pháp cơ bản. Plasmid DNa được mutagen -hóa in vitro, sau đó được đưa vào E. coli bằng biến đổi. Phụ thuộc vào phương pháp, các dòng vô tính đột biến có thể được phân lập và khảo nghiệm riêng, hoặc một thư viện của plasmid đột biến có thể nhận, được xử lý bằng sử dụng phương pháp thanh lọc di truyền.

Vị trí endonuclease ức chế cắt cung cấp phương pháp tiếp cận giản đơn nhất để tạo mutagen

Một trong các khảo nghiệm đầu được thực hiện với một đoạn gien DNA vô tính là vẽ bản đồ các vị trí của điểm chia cắt endonuclease ức chế cắt trên DNA bằng sử dụng một bộ enzim khác nhau. Dù cho thông tin này có thể nhận một cách chính xác từ chuỗi DNA, việc vẽ bản đồ các vị trí ức chế cắt có thể được hoàn tất nhanh và thường được thực hiện phù hợp với việc tạo chuỗi. Các vị trí nhận biết endonuclease ức chế cắt tạo ra một phương pháp giản đơn nhất để sửa đổi một dòng vô tính DNA in vitro (Hình 11-2). Việc phân chia plasmid DNA với một enzim ức chế cắt chỉ nhận biết một vị trí tạo ra một phân tử tuyến tính. Điều này phục vụ như là một đầu vào để sửa đổi chuỗi DNA trong vùng lân cận vị trí ức chế cắt. Thí dụ, enzim EcoRI nhận biết chuỗi GAATTC và tạo ra các đầu với 5’treo. Các đầu có thể thực hiện bằng (cùn) bằng xử lý DNA chia cắt có DNA polymerase với sự hiện diện của deoxyribonucleotide triphosphate. Hai đầu cùn sau đó có thể liên kết lần nữa với nhau (cột thắt) bằng cách ủ phân tử plasmid tuyến tính với DNA ligase. Vài nanogram DNA của phản ứng cột thắt in vitro được sử dụng để biến đổi E. coli, và plasmid sửa đổi mới được phân lập khỏi một trong các khuẩn lạc kết quả. Kết quả thuần của các thao tác là để chèn 4 bp vào trong plasmid ở vị trí EcoRI. Thay đổi, một đột biến mất đoạn nhỏ có thể được tạo ra bằng cách xử lý DNA tuyến tính hóa với S1 nuclease, chuyên tính tiêu hóa DNA có sợi đơn. Điều này tạo ra các đầu cùn bằng cách lấy đi bốn nucleotide tạo thành đầu treo 5’ được phát sinh bởi EcoRI ở mỗi đầu. Sự cột thắt kế tiếp của DNA trong một phân tử vòng liên kết lưỡng trị do đó dẫn đến mất đoạn 4 bp khỏi DNA. Trong từng thí dụ, chuỗi mới không còn mã vị trí nhận biết EcoRI. Các kiểu thao tác này, nếu được thực hiện với một chuỗi mã protein, có thể làm thay đổi khung đọc sao mã, dẫn đến việc sản xuất một protein tay đổi lớn. Giới hạn chính của việc sử dụng vị trí ức chế cắt để tạo ra đột biến là có thể giản đơn không phải là các vị trí trong vùng gien người nghiên cứu muốn thay đổi.

Hình 11-2 (trang 193) Việc tạo ra một đột biến bằng cách thao tác một vị trí ức chế cắt. Plasmid DNA được chia cắt endonuclease ức chế cắt EcoRI, phát sinh một đoạn gen tuyến tính có đầu 5’ có 4 nucleotide không sánh đôi (có tên là đầu dính). Nghiệm thức với nuclease S1 (trái) lấy đi các nucleotide này, và đoạn gen tuyến tính sau đó được xử lý với DNA ligase. Phân tử vòng kết quả chứa một mất đoạn 4 bp. Thay đổi, việc thêm DNA polymerase và deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) với plasmid được chia cắt bởi EcoRI mở rộng đầu 3’ bởi tổng hợp DNA (phải). Sau sự cột thắt, phân tử kết quả chứa một đoạn gen chèn 4 bp. Trong cả hai trường hợp, vị trí EcoRI đã bị phá huỷ.

Việc chèn linker được sử dụng đẻ vẽ bản đồ một transposon vi sinh

Chúng ta đã hiểu rõ là có một vấn đề giản đơn để chia cắt một plasmid với một emzim ức chế cắt, làm cùn các đầu bằng cách xử lý với một DNA polymerase và nối kết các đầu lại bằng phương pháp cột thắt. Một biến dị trong phương pháp này là để nối kết các đầu lại với sự hiện diện của một oligonucleotide tổng hợp “linker”, thường một mã một vị trí ức chế cắt. Việc chèn linker làm gián đoạn chuỗi gien, vị trí của linker chèn có thể được vẽ bản đồ dễ dàng bằng cách chia cắt plasmid có enzim ức chế cắt cắt linker.

Một phương pháp tương tự được sử dụng để xác định vùng hoạt động của một yếu tố có thể đổi chỗ vi sinh (một “gien nhảy” xem chương 10), bằng cách chèn linker ở nhiều vị trí thay đổi trên khắp yếu tố. Để đặt đoạn gien chèn linker trên transposon, một plasmid mang một dòng vô tính của transposon được xử lý với một nuclease chia cắt plasmid ở các vị trí ngẫu nhiên (Hình 11-3). Điều kiện chia cắt được chỉnh để cho mỗi plasmid chỉ được cắt một lần tính theo trung bình. Phân tử tuyến tính hóa được phân lập và được cột thắt thành các vòng một lần nữa với sự hiện diện của một oligonucleotide linker 8-bp chứa một vị trí ức chế cắt EcoRI, dẫn đến sự chèn linker vào vị trí ngẫu nhiên, một trên mỗi plasmid. Plasmid kết quả được biến đổi thành E. coli và, sử dụng một phương pháp thanh lọc di truyền, khảo sát để xem nếu transposon có thể nhảy. Việc chèn một linker vào trong một vùng của transposon quan trọng đối với hoạt động của nó khử kích hoạt nó, giả định bằng cách đặt một chuỗi mã protein ngoài khung. Bằng cách vẽ bản đồ các vị trí của linker chèn bằng phân tích ức chế cắt, các vị trí của vùng hoạt động của transposon được suy luận ra.

Hình 11-3  Việc tạo mutagen sao chép linker để vẽ bản đồ vùng hoạt động của một yếu tố có thể đổi chỗ vi sinh. Plasmid bắt đầu chứa một transposon nguyên vẹn, một gien kháng ampicillin để chọn trên E. coli, và các chuỗi để lập lại plasmid. DNA được xử lý với một nồng độ thấp deoxyribonnuclease 1 với sự hiện diện của Mn²⁺. Trong các điều kiện này, enzim tạo ra vị trí cắt có sợi đôi tại các vị trí ngẫu nhiên trên plasmid, phát sinh một bộ sưu tập phân tử DNA tuyến tính gãy đoạn ở các vị trí khác nhau. Oligonucleotide linker mã một vị trí ức chế cắt EcoRI được thêm vào các đầu với DNA ligase, các phân tử tuyến tính được xử lý với EcoRI endonuclease để tạo ra các đầu đính trên linker, và các phân tử được tái lưu hành. Các phân tử vòng được biến đổi thành E. coli, và các khuẩn lạc kháng ampicillin được chọn. Plasmid DNA được phân lập khỏi các khuẩn lạc cá thể, được đưa vào trong một dòng E. coli khác, và khảo nghiệm về hoạt động của transposon. Các vị trí của linker chèn được vẽ bản đồ bởi tiêu hóa ức chế cắt. Các linker chèn trong một vùng (xanh) của plasmid khử kích hoạt transposon. Không có đoạn gen chèn linker trên gen kháng ampicillin được thu hồi, vì các plasmid này có thể không thành công trong việc cho một khuẩn lạc kháng thuốc trong việc chọn theo xuất xứ của E. coli biến đổi.

Việc xây dựng các bản đồ mất đoạn có tổ các ranh giới của một vùng kiểm tra sao chép

Việc sao chép của gien mã phân tử RNA ribosome 5S được thực hiện bởi RNA polymerase III (pol III, xem chương 8). Để nhận dạng các chuỗi trên gien 5S cần cho việc sao chép bởi pol III, một chuỗi biến đổi mất đoạn được tạo ra và được khảo nghiệm về khả năng của chúng để hỗ trợ việc sao chép chính xác. Hai bộ mất đoạn được tạo ra. Một được tạo ra bằng cách cắt một plasmid mang một gen 5S vô tính ở một vị trí ức chế cắt trên cạnh 5’ của gen. Plasmid tuyến tính hóa được xử lý với một phối hợp nuclease tiêu hóa DNA khỏi các đầu của phân tử (Hình 11-4). Lượng DNA bị lấy đi được kiểm tra bởi thay đổi thời gian, nhiệt độ, hoặc nồng độ enzim trong phản ứng. Một bộ mất đoạn thứ hai được phát sinh từ plasmid DNA được chia cắt ở một vị trí trên cạnh 3’ của gen. Kết quả là hai bộ plasmid có các mất đoạn lớn dần về phía gien từ cả hai hướng. Việc khảo nghiệm các gien này cho biết là chỉ các mất đoạn đi vào trong vùng 35-bp trong vùng được sao chép của gen 5S hủy bỏ sao chép bởi pol III. Vì vậy, việc phân tích mất đoạn này vẽ bản đồ yếu tố điều tiết sao mã với băng 35-bp này, được phân tích tiếp chi tiết nhiều hơn bởi tạo mutagen có định hướng vị trí.

Một số kiểu enzim khác nhau có thể được sử dụng để tạo ra mất đoạn. Thường, các enzim này làm mất đoạn DNA khỏi cả hai đầu của một phân tử plasmid tuyến tính hóa. Tuy nhiên, thường một đầu phân tử chứa các chuỗi cần dược giữ lại trên plasmid vì, thí dụ, chúng cần cho việc lập lại plasmid. Trong khảo nghiệm mất đoạn của gen 5S, giới hạn này được thích ứng bởi việc phân lập các gien mất đoạn và vô tính chúng lại thành một vectơ mới. Một cách thay đổi, một phương pháp có thể sử dụng giới hạn sự mất đoạn ở một đầu của phân tử plasmid tuyến tính hóa (Hình 11-5). Phương pháp này được sử dụng rộng để phát sinh mất đoạn có tổ để tạo chuỗi DNA (xem chương 7).

Hình 11-4  Xây dựng một bộ tổ biến đổi mất đoạn  để vẽ bản đồ kiểm tra vùng sao mã của một gien RNA ribosome 5S (a) Một vô tính plasmid được tuyến tính hóa với một enzim ức chế cắt ở một vị trí (A) trên cạnh 5’ của gen. Các đoạn gien tuyến tính được xử lý với một exonuclease, tiêu hóa DNA từ cả hai đầu của phân tử. Các phần của phản ứng  được lấy đi ở các thời điểm khác nhau để thu hồi các quần thể phân tử có mất doạn lớn dần. Linker được thêm vào các đầu, và các phân tử được chia cắt với enzim ức chế cắt chuyên tính với các vị trí B và C, để tách riêng đoạn gien của gen 5S khỏi phần còn lại của vectơ. Các đoạn gien được vô tính lại thành một vectơ mới, tạo ra một bộ biến đổi mất đoạn phải. Để tạo ra các biến đổi mất đoạn trái, quá trình này được lập lại sau khi chia cắt plasmid ở vị trí ức chế cắt B, (b) các plasmid cá thể được phân lập sau biến đổi, các đầu mất đoạn của chúng được xác định bởi việc tạo chuỗi DNA, và khả năng của chúng để hỗ trợ việc sao chép bởi RNA polymerase III khảo nghiệm với một khảo nhiệm in vitro. Như có thể được thấy bằng cách so sánh hoạt động sao mã với qui mô mất đoạn, việc sao chép bị ức chế khi mất đoạn bên phải (5’) đi vào vùng +40 và khi mất đoạn bên trái (3’) đi qua vị trí +80. Điều này đề xuất là vùng kiểm tra sao chép nằm giữa +40 và +80. (xem trang 196).

Hình 11-5  Xây dựng mất đoạn đôùc hướng bằng cách sử dụng exonuclease III. Exonuclease III tấn công tùy chọn đầu 3’ của một phân tử DNA tuyến tính với nucleotide đầu nhô 5’. Vì vậy, bằng cách chia cắt một phân tử plasmid ở các vị trí kế cận với BamIII, để lại đầu treo 5’, và Pst1, để lại một đầu treo 3’, chỉ đầu được tạo ra bởi BamIII bị tấn công bởi exonucleasse III. Sau khi xử lý exonuclease III, đuôi có sợi đơn còn lại (cùng với đầu treo ở đầu kia) được lấy đi với nuclease S1, chỉ tiêu hóa DNA có sợi đơn. Một oligonucleotide linker  được gắn. và các đoạn gen được cột thắt để tạo ra các phân tử vòng kín. Trong khảo nghiệm được trình bày ở đây, các mất đoạn đang được sử dụng để vẽ bản đồ vùng hoạt động của một gien vô tính chèn trong một gien hiển thị. Phương pháp này cho phép các mất đoạn chỉ được thực hiện trên gien vô tính, không gây hại chuỗi promoter. (trang 197)

Phương pháp tạo mutagen quét linker cho phép phân tích có hệ thống các promoter

Phương pháp tạo mutagen mất đoạn của gien 5S vẽ bản đồ các ranh giới của vùng kiểm tra sao chép trên gien. Nhưng không phải là tất cả nucleotide trong các ranh giới của vùng 35-bp cần là quan trọng cho hoạt động. Vì vậy, các phương pháp là cần để làm thay đổi nucleotide cá thể trên một tiêu chí mà không phát sinh mất đoạn thô hoặc tái tổ hợp khác. Điều này được hoàn tất với một promoter vi sinh bằng cách sử dụng một sự thích ứng của phát sinh mutagen mất đoạn có tên là “quét linker” (linker scanning). Sử dụng các phương pháp được phác thảo trong Hình 11-4, hai bộ plasmid được xây dựng có chứa mất đoạn trong promoter. Một bộ mất đoạn bắt đầu từ một vị trí đàng sau đầu 5’ và tiến triển về phía gen, để lại đầu 3’ nguyên vẹn; bộ kia bắt đầu từ một vị trí trên gen và tiến triển theo hướng ngược chiều, để lại đầu 5’ nguyên vẹn. Mỗi mất đoạn kết thúc với một linker BamIII 10-bp. Qui mô của mất đoạn trên DNA được xác định đối với từng plasmid bởi việc tạo chuỗi DNA. Các cặp plasmid từ hai bộ mất đoạn với vị trí đầu 10 bp cách xa được tái tổ hợp được tái tổ hợp ở các vị trí BamIII của chúng (Hình 11-6). Hiệu ứng là để bảo lưu độ dài và tổ chức của promoter - được nghĩ sẽ là quan trọng với hoạt động promoter - nhưng để thay thế các đoạn gen 10-bp đa dạng của chuỗi promoter kiểu hoang có chuỗi trên linker. Do đó, khảo nghiệm này tạo ra một thư viện của đột biến promoter cùng cấu trúc nhưng có thay thế nucleotide chia nhóm trong các cửa sổ 10-bp nằm ở các vị trí khác nhau trên promoter. Bô sưu tập này của đột biến chia khoảng độ dài của promoter. Các kết quả của phân tích này được trình bày trong chương 9. Đồng thời, khảo nghiệm này hiển thị phân tích kỹ nhất của một promoter trên một gen của động vật có vú.

Việc thay thế nucleotide ngẫu nhiên nhận được bởi sự biến đổi hóa của DNA hoặc bởi sự không đồng hóa enzim (enzymatic misincorporation)

Trong khi việc quét linker cho phép tạo ra sự thay nucleotide, mỗi đột biến thường chứa một vài thay thế, và các vị trí của đột biến phụ thuộc vào mức khả dụng của mất đoạn đặt thích hợp. Vì vậy, một số phương pháp đã được phát triển để đặt các thay thế nucleotide đơn ở các vị trí ngẫu nhiên trên một phân tử DNA. Các phương pháp giản đơn nhất sử dụng hóa chất biến đổi hoặc gây hại DNA. Thường, plasmid DNA hoặc các đoạn gien DNA được xử lý với các hóa chất, đực biến đổi thành E. coli, và nhân giống như một thư viện của plasmid biến đổi. Các hóa chất được sử dụng phổ biến nhất để phát sinh mutagen in vitro gồm có sodium bisulfite, khử amin -hóa tồn dư cytosine thành uracil, các thuốc thử gây hại hoặc lấy đi base, do đó ngăn ngừa việc ghép đôi Watson -Crick thường (các điều này gồm có hydrazyne và formic acid, được sử dụng trong việc tạo chuỗi DNA Gilbert Maxam, chương 5). Thường nhất, tính phát sinh mutagen hóa được thực hiện trên DNA có sợi đơn và theo sau là việc tổng hợp in vitro của sợi bổ sung sử dụng một DNA polymerase (Hình 11-7). Việc tổng hợp này đưa đột biến vào sợi mới. Trên DNA được xử lý với bisulfite, một adenine nucleotide được đưa vào đối mặt với uracil, sau khi biến đổi thành E. coli, bp G-G kiểu hoang trở thành cặp T -A. Trên DNA có xử lý với thuốc thử loại base, nucleotide bất kỳ có thể được đưa đối mặt với vị trí “abasic” (không base), vẫn còn giữ cột sống deoxyribose dù cho nó đã mất base của nó. Giới hạn chính của phát sinh mutagen hóa là chuyên tính của phát sinh mutagen với thuốc thử bislfite cá thể, thí dụ, chỉ làm thay đổi cytosine.

Hình 11-6  Phương pháp phát sinh mutagen quét linker của promoter đối với gen thymidine kinase (TK). Hai bộ biến đổi mất đoạn được tạo ra bắt đầu từ các vị trí ức chế cắt trên các cạnh 5’ và 3’ của promoter bằng phương pháp được trình bày trong Hình 11-4. (Promoter được chia thành ba màu để tạo ra qui mô mất đoạn rõ hơn). Khoảng một trăm plasmid được tạo chuỗi để xác định vị trí đầu mất đoạn của chúng. Các cặp gien mất đoạn, ở đó mất đoạn 5’ của một đoạn gien kết thúc chính xác cuối nguồn 10 bp từ vị trí đầu của mất đoạn 3’ của đoạn gien khác được nhận dạng. Đoạn gien HindIII - BamIII của đột biến mất đoạn 3’ và đoạn gien BamIII -BglII của đột biến mất đoạn 5’ được kết nối thông qua đầu dính BamIII của chúng và vô tính thành một plasmid mới. Phương pháp này cho các phân tử giống như phân tử được trình bày ở dưới: chúng là kiểu hoang trên chuỗi trừ trường hợp để thay thế linker BamIII 10 bp thay chỗ chuỗi giữa hai vị trí đầu của mất đoạn. Trong thí dụ được trình bày, điều này dẫn đến một nhóm tám thay thế nucleotide (mũi tên) (trang 198)

Hình 11-7 Phát sinh mutagen hóa bằng sodium sulfite. Sodium bisulfite phản ứng với cytosine base của DNA có sợi đơn để qui đổi chúng thành uracil, một tương ứng thymine bp với adenine. DNA có sợi đơn được xử lý với sodium bisulfite để biến đổi một số nhỏ tồn dư cytosine trên từng phân tử. Một oligonucleotide primer được ủ với DNA và phục vụ như là một primer để tổng hợp bởi DNA polymerase. Khi polymerase gặp một uracil trên sợi mẫu (template strand), nó đưa một adenine vào DNA mới tổng hợp. Vì các chuỗi vectơ cũng bị hư hại bởi việc xử lý bisulfite, cần chia cắt đoạn gien DNA có sợi đôi bởi chia cắt với endonuclease ức chế cắt và vô tính lại thành một vectơ không bị hư hại. Tiếp theo sự biến đổi thành E. coli, một thư viện của plasmid đột biến có thể được phân lập hoặc plasmid cá thể có thể được tinh chế và khảo nghiệm. Số thay thế trung bình trên đoạn gien DNA có thể được điều khiển bởi việc làm thay đổi các điều kiện xử lý bisulfite. (trang 199)

Tất cả các thay thế nucleotide có thể được phát sinh bằng sử dụng sự đồng hóa sai (misincorporation) enzim. ở đây phương pháp là để thực hiện sự tổng hợp DNA in vitro trong điều kiện không lý tưởng - điều kiện ion -hóa gần tối ưu, nồng độ không cân đối của chất tiền tố nucleotide - thỉnh thoảng khuyến khích DNA polymerase để đồng hóa nucleotid sai trong quá trình tổng hợp. Thí dụ, tổng hợp được thực hiện với sự hiện diện của nồng độ cao của ba chất tiền tố và một nồng độ rất thấp của chất tiền tố thứ tư. ở các vị trí thường gọi là nucleotide thứ tư (hiếm), một trong các chất khác thỉnh thoảng được đồng hóa thay chỗ. Các phương pháp này cũng khai thác DNA polymerase thiếu một hoạt động đọc và sửa mô rát (proofreading)- một cơ chế nuclease 3’-5’ kiểm tra từng bp sau khi đồng hóa và lấy đi nucleotide không phù hợp. Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase, được sử dụng trong PCR (chương 6), thiếu hoạt động như trên. Dù cho đây là một vấn đề khi độ chính xác tổng hợp là cần, PCR một phương pháp hiệu quả rất giản đơn để đưa nucleotide ngẫu nhiên thay thế vào trong một đoạn gien DNA.

Một vấn đề tổng quát với phương pháp tiếp cận phát sinh mutagen ngẫu nhiên là chúng thường tạo ra các biến đổi nhiều hơn một thay thế. Các thay thế nhiều yếu tố trên một đột biến đơn làm phức tạp sự giải đoán của một khảo nghiệm, vì không rõ thay thế nào (hoặc phối hợp thay thế) chịu trách nhiệm về các thay đổi đã khảo sát về các đặc tính của đột biến. Các phương pháp đặc biệt đã được sử dụng để né tránh bài toán này - chủ yếu là, việc làm giảm có ý nghĩa qui mô phát sinh mutagen và sử dụng các qui trình làm giàu để tìm ra các đột biến hiếm - nhưng hầu hết thất cả các phương pháp nay đã được thêm vào bởi các phương pháp mới sử dung oligonucleotide tổng hợp.

Oligonucleotide tổng hợp làm dễ dàng sự phát sinh mutagen

Hầu hết các phương pháp để phát sinh mutagen chúng ta đã thảo luận đến nay có một số thiếu sót có ý nghĩa - chúng dựa trên phương pháp tiếp cận ngẫu nhiên trên một chuỗi thông qua một vị trí ức chế cắt, bắt buộc đầu vào qua phương pháp mất đoạn, hoặc thanh lọc kỹ để tìm ra các đột biến phát sinh ngẫu nhiên trong vùng đang quan tâm. Để là mạnh nhất, việc phát sinh mutagen phải cho phép các nhà khảo nghiệm đặt biến đổi bất kỳ ở vị trí bất kỳ mong muốn trên DNA vô tính. Điều này đã trở thành có thể mà còn giản đơn và rẻ tiền, với sự xuất hiện của oligonucleotide DNA tổng hợp. Oligonucleotide cung cấp phương tiện để tạo ra một đột biến đặc biệt và sau đó để đặt nó chính xác ở nơi mong muốn.

Phương pháp giản đơn nhất để tạo ra phát sinh mutagen có định hướng oligonucleotide bằng phương pháp mở rộng mẫu mồi enzim (Hình 11-8). Trong phương pháp này, một oligonucleotide được tạo ra mang đột biến được cắt ngang sườn bằng 10-15 nucleotide của chuỗi kiểu hoang. Nucleotide “đột biến” này được lai với chuỗi bổ sung của nó trên DNA kiểu hoang có sợi đơn từ một phage hoặc vô tính phage, tạo ra một thể khác hai gen trội (heteroduplex) có các nucleotide không phù hợp ở vị trí của đột biến. Dù cho oligonucleotide không bổ sung hoàn toàn, nó sẽ ủ nếu điều kiện lai tạo không thật là chính xác. Nucleotide phục vụ như là một mẫu mồi để tổng hợp DNA enzim in vitro bởi một DNA polymerase qui đổi DNA có sợi đơn thành dạng có sợi đôi, sử dụng sợi kiểu hoang như bản mẫu. Theo phương pháp này, tất cả các vùng của plasmid trừ trường hợp vùng có chứa oligonucleotide đột biến sẽ là kiểu hoang trên chuỗi. Khi mẫu mồi đã được mở rộng hoàn toàn xung quanh bản mẫu, các đầu của sợi vừa được tổng hợp bị cột thắt, tạo ra một phân tử DNA vòng có sợi đôi. DNA heterroduplex này - một sợi có chuỗi kiểu hoang và sợi kia có chuỗi đột biến - được biến đổi thành E. coli, ở đó sợi bất kỳ có thể được lập lại. Tuy nhiên, trước khi một khuẩn lạc phát triển, nó thường chỉ chứa một kiểu plasmid, kiểu hoang hoặc đột biến. Các kiểu đột biến có thể được tạo ra bằng phương pháp tiếp cận này thay đổi từ nucleotide thay thế đơn đến mất đoạn hoặc đoạn gien chèn, bị giới hạn chỉ bởi kích thước của oligonucleotide cần.

Hình 11-8  Việc phát sinh mutagen có định hướng oligonucleotide bằng mở rộng mẫu mồi enzim. Một oligonucleotide “đột biến” mã đột biến mong muốn nằm trong chuỗi cắt ngang sườn kiểu hoang được ủ trong một bản mẫu DNA có sợi đơn. Chuỗi oligonucleotide được đặt ở giữa và có ít nhất 8-12 nucleotide trên cạnh bất kỳ bp với bản mẫu DNA. Oligonucleotide đột biến phục vụ như một mẫu dò để tổng hợp DNA bởi DNA polymerase. Khi bản mẫu trọn vẹn được sao, các đầu của sợi vừa tổng hợp được liên kết lưỡng trị bởi DNA ligase. DNA heteroduplex (khác hai gen trội) được biến đổi thành E. coli. Theo lý thuyết, cả hai sợi có thể lập lại, phân ly thành đột biến riêng và plasmid kiểu hoang. Tuy nhiên, về mặt thực hành, hầu hết các khuẩn lạc chỉ chứa một trong hai sợi trên, vì enzim trong tế bào nhận biết và sửa chữa các nucleotide không phù hợp trên heteroduplex (khác hai gen trội) trước khi lập lại. Plasmid DNA được phân lập từ các khuẩn lạc kết quả và được chọn để nhận dạng đột biến.

Dòng vô tính đột biến có thể được nhận dạng bằng lai tạo và tạo chuỗi DNA

Theo lý thuyết, phân nửa phân tử con của một phản ứng phát sinh mutagen sẽ là kiểu hoang và một nửa đột biến. Tuy nhiên, trên thực tiễn, phần trăm của plasmid đột biến thường thấp hơn. Điều này là do một đa dạng yếu tố kỹ thuật, nhưng hệ quả là các phương pháp để nhận dạng hoặc làm giàu các vô tính đột biến thì sống. Các phân tử đột biến có thể được phân biệt với kiểu hoang khi được hoặc mất một vị trí ức chế cắt. Một cách thay đổi, oligonucleotide đầu tiên được sử dụng để tạo ra đột biến có thể được sử dụng như là một mẫu dò lai để phân biệt các phân tử đột biến với kiểu hoang (Hình 11-9). Oligonucleotide đột biến được nhãn bức xạ với ³²P-ATP và được lai với DNA của các khuẩn lạc vi sinh trên bộ lọc nitrocellulose, như được trình bày trong chương 7. Nếu nhiệt độ lai tạo được tăng lên 5 hoặc 10^oC, một điểm có thể đạt đến oligonucleotide nhãn nào sẽ chỉ lai với các phân tử đột biến (với phân tử nó bổ sung hoàn hảo), và không với phân tử kiểu hoang vì dòng lai bị khử ổn định hóa bởi các nucleotide không phù hợp. Plasmid DNA được phân lập khỏi một khuẩn lạc E. coli lai mạnh với mẫu dò. Sự xác minh là đột biến mong muốn được thực hiện được hoàn tất bằng tạo chuỗi DNA của vô tính đột biến giả định. Phương pháp này có thể nhận dạng một vô tính đột biến trong số vài trăm vô tính kiểu hoang.

Một số phương pháp thông minh làm giàu cho vô tính đột biến nên nhiệm vụ thanh lọc tỉ mỉ bằng lai tạo là không cần. Trong một trong số các phương pháp này, bản mẫu DNA được dấu sinh học nên bị phá hủy sau khi biến đổi thành E. coli và sợi đột biến được lập lại tùy chọn (Hình 11-10). Theo phương pháp thứ hai, sợi bản mẫu bị phá hủy enzim trước khi biến đổi. Cả hai phương pháp có thể cho đột biến ở một tần số lớn hơn 50%, nên plasmid DNA được phân lập giản đơn khỏi ba hoặc bốn khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên và được phân tích bởi phương pháp tạo chuỗi DNA với mong muốn là một đột biến sẽ được tìm ra trong số DNA đã chọn.

Hình 11-9  Việc tìm kiếm plasmid đột biến bằng sử dụng  oligonucleotide đột biến như là một mẫu dò. Các khuẩn lạc (hoặc tấm) kết quả của sự biến đổi bởi plasmid mutagen -hóa (xem Hình 11-8) được chế phẩm để lai khuẩn lạc trên bộ lọc nitrocellulose sử dụng các phương pháp được trình bày trong chương 7. Oligonucleotide mutagen được nhãn bức xạ bằng phương pháp phosphoryl -hóa đầu 5’ của nó sử dụng ³²P-ATP và polynucleotide kinase. Oligonucleotide nhãn được lai với plasmid DNA trên các bộ lọc nitrocellulose. ở nhiệt độ thấp, oligonucleotide sẽ lai với cả hai DNA đột biến và kiểu hoang. Khi nhiệt độ gia tăng, oligonucleotide không phù hợp lai với plasmid DNA kiểu hoang bắt đầu phân ly khỏi vô tính kiểu hoang. Cuối cùng nhiệt độ đạt đến điểm oligomer không phù hợp phân ly hoàn toàn khỏi vô tính kiểu hoang nhưng vẫn được lai với vô tính đột biến. Từ khi nucleotide được nhãn bức xạ, bộ lọc nitrocellulose được tiếp xúc với phim tia -X và vô tính đột biến được nhận dạng bởi sự hiện diện của một tín hiệu mạnh trên tự chụp ảnh X quang (autoradiograph). DNA plasmid đột biến sau đó được phân lập khỏi khuẩn lạc tương ứng trên đĩa chủ, sử dung bộ lọc lập lại như một hướng dẫn.

Hình 11-10  Sự làm giàu cho các đột biến có định hướng oligonucleotide bằng sử dụng một uracil chứa bản mẫu. DNA mẫu có sợi đơn được chế phẩm trên một dòng của E. coli thiếu enzyme uracil deglycosidase (ung ), sao cho nó chứa một số tồn dư uracil thay cho thymine (Dù cho uracil thường không đồng hóa thành DNA, hiện nó không phải là mutagen và không tạo ra một bp có adenine). Oligonucleotide mutagen được ủ và mồi sự tổng hợp của một sợi mở rộng quanh bản mẫu trong một phản ứng sử dụng bốn dNTP (như trong hình 11-8). Tiếp theo việc cột thắt, các phân tử DNA heteroduplex được đưa vào trong một dòng “ung” của E. coli. Khi ở trong tế bào, sợi kiểu hoang (mẫu) bị tấn công bởi uracil deglycosidase, tạo ra vết gãy trên sợi, và sợi DNA bị xuống cấp trước khi điều này có thể lập lại. Từ khi sợi chứa oligonucleotide mutagen không chứa uracil, điều này không bị tấn công và được lập lại bình thường. Khi phương pháp này được sử dụng, 50% hoặc nhiều hơn khuẩn lạc chứa plasmid đột biến. 

Cassette oligonucleotide tạo ra một phương pháp giản đơn để nhập nội đột biến có định hướng

Chúng ta đã hiểu rõ trước là các vị trí enzim giới hạn mở đường cho một DNA vô tính để phát sinh mutagen. Nếu hai vị trí ức chế cắt ở gần nhau, đoạn gien can thiệp có thể được lấy đi và thay với một đoạn gien có sợi đôi (một cassette) được tạo ra từ hai oligonucleotide có sợi đơn bổ sung mang chuỗi mong muốn bất kỳ. Tuy nhiên, thường các vị trí ức chế cắt thích hợp không thể sử dụng, may thay, điều này là một vấn đề giản đơn tạo ra chúng sử dụng các phương pháp phát sinh mutagen có định hướng oligonucleotide được trình bày trong các phần trước. Khi các vị trí ở tại chỗ, số bất kỳ đột biến mới có thể được tạo ra bằng chèn các đoạn gien tổng hợp vào trong plasmid (Hình 11-11); đúng như là các cassete khác nhau có thể được chèn trong máy ghi âm.

Phương pháp phát sinh mutagen cassette là cơ sở cho một khảo nghiệm lịch sự xác minh một mô hình cấu trúc để nhận biết DNA bằng gien ức chế thể thực khuẩn. Gien ức chế của thể thực khuẩn giống lambda 434 và P22 chứa một cấu trúc vòng xoắn xoay vòng xoắn (helix-turn-helix structure) (xem chương 9) nhận biết DNA điều hành trong bộ genome thể thực khuẩn. Điều được giả định là chuỗi cạnh amino acid trên một mặt của một vòng xoắn alpha trên protein ức chế tạo tiếp xúc chuyên tính chuỗi với DNA điều hành. Để khảo nghiệm giả thuyết này  một vòng xoắn trao đổi (swap) được thực hiện (Hình 11-12). Oligonucleotide được tổng hợp mã amino acid của vòng xoắn trên gen ức chế 434, với 5 vị trí được nghĩ để tiếp xúc DNA đã thay đổi thành vị trí của gien ức chế P22. Đoạn gien tổng hợp này được trao đổi (swapped) với đọan gien tự nhiên trên gen 434. Protein lai kết quả nhận chuyên tính nhận biết của gien ức chế P22, minh chứng là vòng xoắn này thật ra tiếp xúc DNA.

Hiện tượng phát sinh mutagen cassette có oligonucleotide phân ly có thể được sử dụng để tạo ra một bộ sưu tập lớn đột biến ngẫu nhiên trong một khảo nghiệm đơn. Phương pháp này được sử dụng để khảo nghiệm cấu trúc của yếu tố phản ứng glycocorticoid (GRE), một chuỗi nâng cao kích hoạt họ gen đáp ứng lại một số homon steroid. Yếu tố này được vẽ bản đồ bằng phát sinh mutagen mất đoạn với một vùng 30-bp trên một gien điều tiết glucocorticoid. Để xác định chuỗi cần cho hoạt động chính xác của GRE, đội biến điểm đơn trên khắp vùng 30-bp được phát sinh và khảo nghiệm trên tế bào về tính gây cảm ứng bởi homon glucocorticoid. Hai oligonucleotide bổ sung được tổng hợp mang GRE 30-bp, nhưng sự tổng hợp được thực hiện trong các điều kiện trong đó nucleotide không đúng được đồng hóa ở một tần số thấp (Hình 11-13). Các oligonucleotide “được kích thích” (doped) này (nghĩa là oligonucleotide được tạo ra bằng chất kích thích (xem Hình 11-13) được ủ và được chèn như là một cassette trên một promoter thiếu một GRE. Sử dụng phương pháp này, hầu hết thay thế nucleotide đơn ở 30 vị trí nhận được. Một bộ sưu tập đột biến như trên không thể được nghĩ đến trước khi oligonucleotide cách mạng hóa sự phát sinh mutagen in vitro.

Hình 11-11 Phát sinh mutagen bằng thay cassette. Plasmid DNA được chia cắt với enzim ức chế cắt EcoRI và HindIII, cắt ở các vị trí cắt ngang sườn chuỗi bị đột biến. Đoạn gen DNA chia cắt nhỏ chứa một phần chuỗi kiểu hoang bị lấy đi, và một đoạn gien DNA (cassette) chứa đột biến mong muốn bị cột thắt trên plasmid. Đoạn gen DNA đột biến được so với hai oligonucleotide tổng hợp bổ sung có đầu dính EcoRI và HindIII khi được ủ. Vì không có heteroduplex trung gian -cassette đột biến giản đơn được trao đổi với gien kiểu hoang - plasmid tái tổ hợp là tất cả các đột biến. Một cassette đột biến có thể được gồm có oligonucleotide phân ly (xem chương7), dãn đến một thư viện plasmid đột biến chứa chuỗi khác nhau.

Hình 11-12  Khảo nghiệm trao đổi vòng xoắn. Các amino acid trên protein gen ức chế thể thực khuẩn 434 được tin là chịu trách nhiệm về việc nhận biết gien thao tác 434 được thay bởi phát sinh mutagen cassette (Hình 11-11) của DNA 434 với amino acid được tin là thực hiện cùng hoạt động trong một vùng tương ứng của protein ức chế P22 thể thực khuẩn. (a) Hiển thị trên E. coli của protein ức chế 434 (trái), với một mở rộng kích cỡ được tin là liên kết gien điều khiển 434, (phải) phần tương ứng của protein ức chế P22. (b) Một cassette được tổng hợp giống như vùng 434, nhưng với thay thế kiểu P22 ở các vị trí được nghĩ là cần để nhận biết DNA điều khiển P22. Điều này được cột thắt trong plasmid 434 tiêu hóa, và vectơ tái tổ hợp được đưa vào trong E. coli để tạo ra protein lai, sau đó được nhận biết DNA điều khiển P22 nhưng không điều khiển  434.

Hình 11-13  Hiện tượng phát sinh mutagen cassette sử dụng oligonucleotide kích thích để phát sinh nhiều đột biến trong một khảo nghiệm đơn. Một nucleotide cassette mã một yếu tố phản ứng glucocorticoid (GRE) được tổng hợp bởi một máy tổng hợp DNA. Sự tổng hợp được thực hiện trong các điều kiện trong đó mỗi chai chứa một chất tiền tố nucleotide đặc biệt được “lây nhiễm” (kích thích) với lượng nhỏ ba chất tiền tố khác. Trong thí dụ trên, chất tổng hợp DNA được đưa vào để tạo ra một oligonuleotide có chuỗi GGTTACAAACT. Do đó, khi một chất tiền tố nuleotide được tìm kiếm - thí dụ C - máy thêm vào một phân số (aliquot) dung dịch của chai C, và một C base được ghép đôi với đầu của hầu hết các chuỗi oligonucleotide. Tuy nhiên, vì chai C chứa một lượng nhỏ A, G, và T, một base không đúng thỉnh thoảng được thêm để thay. Vì nồng độ C gần gấp 30 lần A, G, và T, một base không đúng sẽ được thêm khoảng 1 trong số 30 phân tử. Điều này dẫn đến một bộ sưu tập kích thích oligonucleotide, thường gồm có nhiều chuỗi khác nhau, một số kiểu hoang và một số thay thế. Mức lây nhiễm được chỉnh để tạo thuận lợi sự tổng hợp oligonucleotide với chỉ một thay thế, nhưng vì các thay thế xảy ra ngẫu nhiên, một số phân tử trong bộ sưu tập không có và các phân tử khác có hai hay nhiều hơn. Cassette được tạo ra bằng cách ủ oligonucleotide kích thích bổ sung và được cột thắt trên một vectơ. Plasmid DNA được phân lập khỏi 546 thể biến đổi E. coli cá thể và được phân tích bằng tạo chuỗi. Trong số, 224 là kiểu hoang, 218 có chứa một thay thế (với 30 bases, đang quan tâm, 74 trong số 90 thay thế đơn có thể được thu hồi), và phần còn lại chứa hai hay nhiều hơn.

Sự tổng hợp gien tạo thuận lợi cho việc sản xuất protein thường và đột biến

Các phương pháp phát sinh mutagen có định hướng oligonucleotide chúng tôi đã trình bày sử dụng một oligonucleotide đơn hoặc một cặp oligonucleotide bổ sung để chèn chuỗi đột biến vào một đoạn gien DNA tự nhiên khác. Với mức khả dụng gia tăng của oligonucleotide dài, điều này nay có thể khả thi để tập hợp một gen trọn vẹn của các đơn vị tổng hợp. Điều này được thực hiện bằng tổng hợp một bộ oligonuleotide, điển hình 40-80 nucleotide dài, có thể được ủ và được cột thắt in vitro để tập hợp một phân tử  DNA có sợi đôi trọn vẹn (hình 11-14). Trong tổng hợp gen, các nhà khảo nghiệm đã kiểm soát hoàn toàn chuỗi của gien. Điều này có thể là kiểu hoang hoặc đột biến theo phương pháp bất kỳ cần. Vì hầu hết các amino acid được mã bởi codon thể ba nhiều yếu tố, gien mã protein kiểu hoang có thể được xây dựng sử dụng codon khác nhau. Codon có thể được chọn để đặt vị trí ức chế cắt độc nhất trên khắp chuỗi để cho cassette đột biến được dễ trao đổi bên trong. Điều này được thực hiện với gien thudopsin vi sinh. Việc đặt lại một đoạn gien của gen tổng hợp với một đoạn gien tổng hợp mới nhận diện amino acid liên kết với thể màu hấp thu quang tử (photon-absorbing chromophore) bắt đầu sự quang tổng hợp. Các đoạn gien khác có thể được trao đổi như cassette để khảo nghiệm các đặc tính cấu trúc quan trọng của protein.

Codon cũng có thể bị thay đổi bởi việc tổng hợp gen để cho phép sản xuất protein ở chừng mực cao trên các loài sinh vật khác. Các khảo nghiệm sinh hóa của protein Fos, được mã bởi một thể phát sinh ung thư tế bào (cellular protooncogene) trên tế bào động vật. (Chương 18), đã bị trở ngại nghiêm trọng bởi sự mất khả năng tạo ra protein trên E. coli. Vấn đề này cuối cùng được giải quyết bằng tổng hợp một phần gen fos hoàn toàn khỏi oligonucleotide, làm thay đổi codon fos tự nhiên thành codon được sử dụng hiệu quả nhất trên E. coli. Sự chèn gen tổng hợp này thành một vectơ hiển thị E. coli cho phép lần đầu sản xuất lượng lớn protein Fos hoạt động. Gien còn được tạo ra với vài vị trí ức chế cắt độc nhất để cho việc phát sinh mutagen cassette nay có thể ghép đôi để khảo nghiệm sinh hóa về hoạt động của Fos.

Hình 11-14  Việc tổng hợp gien bằng phương pháp cột thắt của oligonucleotide bổ sung. Để tổng hợp một gien mã một protein đang quan tâm, một bộ oligonucleotide bổ sung gối nhau được tạo ra có thể được phối hợp để tạo ra một phân tử DNA có sợi đôi mã protein trọn vẹn. Oligonucleotide được trộn chung, hâm nóng ở 90^oC trong vài phút để làm biến chất sợi, và sau đó làm nguội chậm đến nhiệt độ phòng. Trong thời gian này, oligonucleotide được tạo ra để cho mỗi sợi ủ ở hai nucleotide kế cận của sợi đối mặt, bắc cầu chúng. Thường, oligonucleotide thay đổi độ dài từ 40-80 nucleotide được sử dụng trong việc tổng hợp gien. Oligonucleotide ủ được liên kết lưỡng trị bởi DNA ligase, tạo ra hai sợi DNA kế cận nhau. Gen tổng hợp này thường được thanh lọc khỏi một jel trước khi cột thắt trên một vectơ. Plasmid tái tổ hợp kết quả nhận được tiép theo sự biến đổi thành E. coli và được tạo chuỗi để kiểm tra chuỗi đúng được tổng hợp. Chuỗi của gien tổng hợp có thể được tạo ra để đặt vị trí ức chế cắt ở các vị trí thích hợp để phát sinh mutagen đột biến cassette.

PCR có thể được sử dụng để xây dựng gien mã protein dị dạng (chimeric protein)

Việc tạo ra đột biến có thể được thực hiện dễ dàng trên một protein mã chuỗi đã cách mạng hóa khảo nghiệm về hoạt động của protein. Một vùng hoạt động có thể được nhận dạng bằng cách tạo ra một chuỗi protein đột biến, sau đó khảo nghiệm thay thế nào tạo ra một thay đổi về hoạt động. Tuy nhiên, thường không dễ quyết định nơi nào để tạo ra một đột biến. Trong thí dụ của khảo nghiệm về việc trao đổi vòng xoắn (hình 11-12), vùng liên kết DNA đã được nhận dạng trước. Và thể thức khảo nghiệm được hướng dẫn bằng cách có một mô hình với cấu trúc ba -chiều của protein ức chế. Tuy nhiên, đối với hầu hết protein, ít thông tin về cấu trúc có thể sử dụng. Việc nhận dạng một vùng hoạt động - thí dụ, một vùng protein có thể phản ứng tương hỗ với một potein khác - thì khó thực hiện bằng cách kiểm tra chuỗi amino acid sơ cấp. Một phương pháp giản đơn giúp thu hẹp amino acid quan trọng trên một protein là sự phân tích các thể khảm (chimeras) giữa các protein có liên quan. Chúng tôi đã trình bày trước việc sử dụng chương trình trên máy vi tính để nhận dạng các protein có liên quan bằng so sánh các chuỗi amino acid của chúng (Chương 8). Các protein khảm (chimeric proteins) được xây dựng bằng bằng cách thay một đoạn gien của một protein với đoạn gien đồng dạng của một protein khác. Dù cho hai protein có khác biệt về hoạt động, tính đồng dạng chuỗi của chúng thường chỉ dấu là chúng chia sẻ một cấu trúc tổng thể chung. Một thí dụ rõ nét về điều này là trong việc phân tích homon sinh trưởng của con người (hGH). Một chuỗi protein khảm được thực hiện trong đó hầu hết các amino acid được phát sinh từ hGH nhưng chứa đoạn gien của homon liên quan, như là prolactin người. Sử dụng phương pháp này, các vùng hGH phản ứng tương hỗ với thể nhận hGH được nhận dạng. Trong chương 17, chúng ta sẽ xem làm thế nào vùng hoạt động của một thể nhận chia khoảng màng bảy lần được nhận dạng bằng khảo nghiệm các thể khảm.

Thể ức chế 434/P22 (Hình 11-12) và thể khảm hGH được xây dựng bằng cột thắt oligonucleotide cassette ngắn trong chuỗi mã. Một phương pháp khác nhau (Hình 11-15) được sử dụng để chế phẩm một kháng thể khảm trong đó một đoạn gien 400-bp từ một gien chuỗi nặng g1 được thay bởi đoạn gien đồng dạng của một gen g2b. Đoạn gien DNA 400-bp được phát sinh bởi PCR mã chuỗi mới sẽ được chèn và hai chân dính (sticky feet) 30-base trên mỗ đầu. Đoạn gien PCR có sợi đôi được hâm nóng để làm biến chất hai sợi, và sau đó một trong các phân tử có sợi đơn được sử dụng trong một khảo nghiệm mở rộng primer (như trong hình 11-8). Nếu phương pháp tổng hợp gien được sử dụng, việc xây dựng gien khảm có thể đã cần hai mươi oligomer dài 40-nucleotide. Thay vì, phương pháp chân dính chỉ sử dụng hai oligonucleotide primer cho PCR.

Hình 11-15  Việc xây dựng một gien mã chuỗi nặng của kháng thể khảm bởi phát sinh mutagen có định hướng chân dính. Các kháng thể chứa một chuỗi nặng g2b  được biết tham gia phân giải tế bào phụ thuộc vào phần bổ sung, nhưng trái lại các kháng thể chứa chuỗi nặng g1 thì không. Để nhận dạng vùng nào của chuỗi nặng g2b chịu trách nhiệm về đặc tính này, một kháng thể chứa một chuỗi nặng khảm được tạo ra. Để xây dựng một gien mã chuỗi nặng khảm, một đoạn gien 400-bp mã vùng C₁₁2 của một chuỗi nặng g1 được thay với đoạn gien đồng dạng của một gen g2b. Vì không có vị trí ức chế cắt thích hợp ở các đầu của đoạn gien C₁₁2, DNA g2b 400-nucleotide dài được chế phẩm bởi PCR. Primer PCR được bổ sung vào các đầu của DNA g2b ranh giới của vùng g1 C₁₁2. Các sợi của đoạn gen phát sinh từ PCR được chế phẩm bằng hâm nóng, sau đó một sợi được sử dụng như primer trong một khảo nghiệm phát sinh mutagen sử dụng bản mẫu g1 DNA có sợi đơn chứa uracil bởi phương pháp được trình bày trong Hình 11-10. Gen của chuỗi nặng khảm kết quả cùng được hiển thị với một gien của chuỗi nhẹ trên các tế bào động vật có vú để tạo ra một kháng thể nay kích hoạt vật bổ sung. Vì chỉ vùng C₁₁2 đến từ chuỗi nặng g2b, kết quả này đã minh chứng là vùng g2b C₁₁2 chứa thông tin cần để kích hoạt phân giải tế bào phụ thuộc phần bổ sung. Việc phát sinh mutagen có định hướng chân cung cấp một phương tiện giản đơn để xây dựng gen phức tạp này.

Việc phát sinh mutagen là cửa ngõ cho hoạt động gien và chuyển gien protein

Có thể là khó ước tính quá mức tầm quan trọng của phương pháp phát sinh mutagen in vitro cho môn sinh học và công nghệ sinh học. Việc khai thác enzim điều hành DNA và tinh chế tổng hợp oligonucleotide đã tạo ra chuỗi gien thay đổi một nhiệm vụ quan trọng nhất. Và khả năng điều hành trên DNA cho chúng ta thay đổ cấu trúc của các sản phẩm gien - RNA và, quan trọng nhất, protein. Do đó, ảnh hưởng của công nghệ này có tính hai mặt. Điều này đã cách mạng hóa làm thế nào nghiên cứu được thực hiện trong sinh học phân tử bằng cách tạo ra quan điểm mới hoàn toàn “di truyền ngược” (reverse genetics), trước hết thay đổi chuỗi gien, sau đó khảo sát hoạt động gien. Và điều này mở cửa cho chuyển gien protein phức tạp (xem chương 23), khả năng để tạo ra thay đổi trên sản phẩm gen tự nhiên làm cho công việc của họ tốt hơn. Ảnh hưởng của phương pháp chuyển gien protein trong y học và công nghiệp sẽ là quan trọng.

RGC 07-09-2006

Trở về Trang Chính