|
-
Phương pháp nhân giống vô
tính phân tử
-
Plasmids như là vectơ nhân
giống vô tính
-
Thực thể khuẩn lambda như
một vectơ nhân giống vô tính
-
Các vectơ khác
-
Sinh vật ký chủ với vectơ
nhân giống vô tính
-
Phương pháp tìm ra dòng vô
tính đúng
-
Các vectơ biểu hiện
-
DNA tổng hợp
-
Phương pháp khuếch đại
DNA: phản ứng của dãy polime
-
Phương pháp nhân giống vô
tính và biểu hiện gien của dãy polime
-
Phương pháp nhân giống vô
tính và biểu hiện gen của động vật có vú trên vi sinh
-
Phương pháp biến đổi gien
có định hướng điểm và in vitro (trong nhà kính)
-
Phương pháp áp dụng thực
hành về việc chuyển gen
-
Sản xuất những sản phẩm
của động vật có vú và vacxin bởi vi sinh vật chuyển gien
-
Phương pháp chuyển gien
trong cây nông nghiệp
-
Phương pháp chuyển gien
trong di truyền học động vật và con người
-
Phương pháp chuyển gien
như là một công cụ khảo nghiệm vi sinh
-
Tóm tắt những nguyên tắc
về cơ sở di truyền chuyển gien
Thuật ngữ:
Công nghệ sinh học
(biotechnology) dùng với những sinh vật sống trong việc thực
hiện những qui trình trong công nghệ ứng dụng.
In DNA
(DNA fingerprinting) dùng trong những phương pháp
chuyển gien trong việc xác định xuất xứ của DNA trên mối mẫu mô
Thư viện DNA
(DNA library) một bộ sưu tập những đoạn gien vô tính tổng số có
những gien vô tính biểu hiện bộ genome hoàn toàn của một sinh
vật, còn có tên là thư viện gien
Vectơ biểu hiện
(expression vector) một vectơ vô tính có những chuỗi điều khiển
cần trong việc cho phép sao in và giải mã những gien vô tính
Sự ngắt quãng gien
(gene disruption) dùng trong những phương pháp di truyền để khử
hoạt hóa một gien bằng cách chèn trong nó một đoạn gien DNA có
một dấu có thể chọn dễ. Đoạn gien đã chèn có tên là một
cassette, và trong quá trình chèn, hiện tượng phát sinh đột biến
cassette.
Gien trị liệu pháp
(gene therapy) thay hoặc tăng gien loạn chức năng có mục đích y
học
Nhân giống vô tính phân tử
(molecular cloning) phân lập hoặc hòa nhập một đoạn gien DNA vào
trong một vectơ trong đó điều này có thể dược sao in.
Con dò nucleic acid
(nucleic acid probe) một thể sợi nucleic acid có thể có nhân và
được dùng trong việc lai tạo với một phân tử phụ từ một hỗn hợp
những nucleic acids khác.
Phản ứng dãy polime
(chất đa phân) (PCR=Polymerase Chain Reaction) một phương pháp
được dùng để khuếch đại một dãy DNA đặc biệt in vitro
bằng những chu kỳ tổng hợp lặp lại (sao in) bằng cách dùng những
con mồi (primers) và DNA polime,
Sự giải mã ngược
(reverse translation) quá trình tinh thần dùng một bản codon và
một dãy amino acid của một protein trong việc nhận một dãy cơ
thể của mRNA hoặc gien mã protein.
Vectơ con thoi
(shuttle vector) một vectơ vô tính có thể sao in thành hai hoặc
nhiều hơn những sinh vật ký chủ không giống nhau.
Phát sinh đột biến gien có định hướng điểm
(site-directed mutagenesis) một phương pháp theo đó một gien có
một thể đột biến đặc biệt có thể được tạo ra
in vitro
DNA tổng hợp
(synthetic DNA) một phân tử DNA được tạo ra bởi một quá trình
trong phòng thí nghiệm
T- DNA
một đoạn gien của Agrobacterium Ti plasmid được chuyển
giao cho những tế bào thực vật
Ti- plasmid
một plasmid trên loài Agrobacterium có thể chuyển giao
gien từ vi sinh sang thực vật
Sinh vật trao đổi thông tin di truyền
(transgenic organisms) thực vật hay động vật đi tiếp một cách ổn
định trên DNA vô tính được chèn vào chúng.
Những
quan điểm về di truyền phân tử, được mô tả trong bốn chương
trước, đã tạo điều kiện cho sự phát triển của các phương pháp
tinh vi sự phân lập, sử dụng, và biểu hiện vật liệu di truyền,
một lãnh vực có tên là phương pháp chuyển gien. Phương pháp
chuyển gien có nhiều hình thức áp dụng trên cả hai phương pháp
nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. Trong công tác nghiên cứu cơ bản,
phương pháp chuyển gien được sử dụng để khảo sát các phương pháp
biến đổi gien và thể hiện trên prokaryotes (tiền hạch),
eucaryotes (chân hạch), và những virut của chúng. Một số ngành
cơ bản quan trọng nhất cho phép phát triển cấy vi sinh có thể
tạo ra các sản phẩm có giá trị như là insulin người, homon sinh
dưỡng của người, vaccines, và enzim công nghệ. Phương pháp
chuyển gien đối với việc ứng dụng thương phẩm, thỉnh thoảng có
tên là công nghệ sinh học, hình như có tiềm năng không giới hạn.
Dưới
phương pháp chuyển gien là sự phân lập, biến đổi và sao chép của
các đoạn gien DNA đặc biệt, quá trình có tên là phương pháp nhân
giống vô tính phân tử. Có số lượng lớn DNA tinh chế cho phép xác
định vị trí, mô tả đặc tính và sử dụng gien và sản phẩm của
chúng. Mỗi DNA vô tính chúng tôi có thể xác định chuỗi
nucleotide của một gien, từ đó chúng tôi có thể dẫn xuất, thông
qua mã di truyền, chuỗi amino acid của sản phẩm protein của nó.
DNA vô tính chính nó có thể được sử dụng như là một con dò để
xác định cấu trúc của phân tử DNA giống phức tạp như bộ genome
của con người. Bằng cách lấy những gien từ sinh vật khó hay nguy
hiểm để làm việc với và đưa chúng vào trong vi sinh vật một cách
an toàn, được mô tả tốt, những chất sinh học có giá trị có thể
được tạo ra rẻ tiền và số lượng lớn không thể ngờ cho đến khi
xuất hiện phương pháp chuyển gien. Bằng cách thay đổi chuỗi gien
vô tính theo một phương pháp được xác định trước, các nhà chuyển
gien có thể tạo ra những sản phẩm sinh học có thể là bổ ích,
mới, giản đơn, và không thể sử dụng từ tài nguyên thiên nhiên.
Trong
chương này chúng tôi trình bày những công cụ và qui trình liên
quan đến việc tạo ra và tinh chế các gien mong đợi bởi các
phương pháp sử dụng sự tái tổ hợp in vitro, tái tổ hợp
DNA. Phương pháp nhân giống vô tính liên quan đến việc tạo ra
DNA tái tổ hợp và đưa vào nó một tế bào ký chủ ở đó điều này sẽ
được sao in lại. Sau đó chúng tôi mô tả làm thế nào phương pháp
chuyển gien được sử dụng để tạo ra số lượng lớn sản phẩm gien
mong đợi và làm thế nào những sản phẩm tự chúng có thể bị thay
đổi bởi phương pháp biến đổi gien có định hướng điểm. Chúng tôi
trình bày những ví dụ về kết quả thực tiễn phát sinh từ phương
pháp chuyển gien và kết luận chương này với một tham khảo lại
các nguyên lý nằm dưới công nghệ sinh học.
10.1
Phương pháp nhân giống vô tính phân tử
Phương
pháp nhân giống vô tính phân tử tại cơ sở của hầu hết các phương
pháp chuyển gien. Mục đích của phương pháp nhân giống vô tính
phân tử (còn có tên là phương pháp nhân giống vô tính gien) là
để phân lập số lượng lớn gien đặc biệt dưới hình thức thuần
chủng. Trong khi điều này theo lý thuyết có thể phân lập cơ học
các đoạn gien DNA thuần chủng có những gien đơn của tiêu hóa
enzim giới hạn của một DNA nhiễm sắc thể (Phần 6.4), một ít phản
ánh sẽ minh chứng tính không thực tiễn của một phương pháp như
trên. Khảo sát về một sinh vật giản đơn di truyền như
Escherichia coli, một gien đặc biệt biểu hiện 1-2
kilobases (kb) trong một bộ genome của khoảng 4700kb. Một gen
E. coli trung bình do đó ít hơn 0,05% DNA tổng cộng
trong tế bào. Trên con người, vấn đề còn tồi hơn vì các vùng mã
của các gien trung bình không lớn nhiều hơn so với E. coli
nhưng bộ genome là 1000 lần lớn hơn. Ngược lại, DNA của thực thể
khuẩn lambda chỉ là 50kb, và DNA của một số plasmid nhỏ hơn 5kb.
Trên các yếu tố di truyền này, một gien trung bình riêng tạo
thành 2-40% DNA.
Do đó,
phương pháp cơ bản nhân giống vô tính phân tử là để di chuyển
gien mong muốn từ một bộ genome phức tạp, lớn đến một bộ genome
giản đơn, nhỏ. May thay, sự hiểu biết của chúng ta về hóa học
DNA và enzim học cho phép chúng ta phá vỡ và liên kết các phân
tử DNA in vitro. Phương pháp này được biết như là phương
pháp tái tổ hợp in vitro. Các enzim giới hạn, DNA ligase
(phần 6.4 và 6.5p) và DNA tổng hợp (xem phần 10.8) là công cụ
quan trọng được sử dung để tấi tổ hợp trong nhà kính.
Phương pháp nhân giống vô tính phân tử
có thể được chia ra thành nhiều bước:
Sự phân lập và sự phân đoạn của DNA nguồn.
Điều này có thể là DNA genomic tổng cộng của một sinh vật đang
quan tâm. DNA được tổng hợp từ một bản mẫu RNA bởi transcrptase
ngược (phần 8.22 p), DNA được tổng hợp bởi phản ứng chuỗi
polymerase (xem phần 10.9) hay ngay cả DNA tổng hợp của
nucleotides in vitro. Nếu DNA genomic là nguồn, điều này
thường được cắt với emzim giới hạn để cho một hỗn hợp của các
đoạn gen.
Sự liên kết các đoạn gen thành một vectơ vô tính
có DNA ligase.
Những yếu tố di truyền sao in độc lập, nhỏ được sử dụng để sao
in gien được biết như là những vectơ nhân giống vô tính. Những
vectơ vô tính thường được chỉ định để cho phép tái tổ hợp DNA lạ
tại một điểm giới hạn cắt vectơ theo một phương pháp không ảnh
hưởng sự sao in nó. Nếu DNA nguồn và vectơ được cắt với cùng một
enzim giới hạn, sự liên kết có thể được trung gian bởi việc ủ
các vùng có sợi đơn gọi là “đầu dính” (sticky ends) (xem các
phần 6.4 và 6.11). Các đầu cùn phát sinh bởi các enzim giới hạn
khác nhau của các thể liên kết hay thể tổng hợp DNA tổng hợp.Các
đặc tính của các vectơ vô tính được trình bày trong các phần
10-2, 10-4.
Sự đưa vào và sự bảo dưỡng của một sinh vật ký
chủ. Phân tử
DNA tái tổ hợp được tạo ra trong một ống nghiệm được đưa vào
trong một sinh vật ký chủ, thí dụ, bởi phương pháp biến đổi DNA
(phần 9.6p) ở đó chúng có thể sao in. Sự chuyển giao DNA vào
trong sinh vật ký chủ thường cho một dòng hỗn hợp vô tính. Một
số tế bào chứa gien vô tính mong muốn, nhưng trái lại các tế bào
khác chứa các dòng vô tính khác phát sinh từ phương pháp liên
kết DNA nguồn đến vectơ. Một hỗn hợp như trên được biết như là
thư viện DNA hay một thư viện gien vì nhiều dòng vô tính khác
nhau có thể được tinh chế từ hỗn hợp, mỗi dòng chứa các đoạn
gien DNA vô tính khác nhau từ một sinh vật nguồn.
Sự phát hiện và sự tinh chế của dòng vô tính mong
đợi. Thường
một trong các nhiệm vụ khó nhất là việc phát hiện dòng vô tính
đúng trong một hỗn hợp có thể chứa hàng ngàn dòng vô tính khác.
Các phương pháp để tìm ra dòng vô tính đúng sẽ được trình bày
trong phần 10.6.
Sự sản
xuất số lớn các tế bào hay thực thể khuẩn chứa dòng vô tính mong
đợi để phân lập và khảo sát DNA vô tính.
Câu hỏi kiểm tra về quan điểm:
Sự phân
lập những số lượng lớn của một gien đặc biệt bằng phương pháp
nhân giống vô tính phân tử thường được thực hiện bằng cách sử
dụng một plasmid hay virus như là vectơ vô tính. Những enzim
giới hạn và DNA ligase được sử dụng trong một phương pháp tái tổ
hợp in vitro để tạo ra một dòng lai phân tử DNA. Khi được
đưa vào trong một sinh vật ký chủ, DNA mục tiêu có thể được tạo
ra để kiểm tra vectơ vô tính.
Mục
đích của phương pháp nhân giống vô tính là gì?
Các vai
trò của một vectơ vô tính, các enzim giới hạn, và DNA ligase
trong phương pháp nhân giống vô tính là gì?
10.2 Plasmids như các vectơ vô tính
Các plasmids sao chép một cách không lệ thuộc của
nhiễm sắc thể ký chủ (phần 9.8 p).
Thêm vào việc mang gien cần có sao in của chính chúng, hầu hết
các plasmids là vectơ tự nhiên vì chúng thường mang các gien
khác cho những sinh vật ký chủ của chúng các đặc tính quan trọng
(phần 9.8 p). Những gien trên có thể nhận bởi tái tổ hợp trong
sinh vật ký chủ. Trong phương pháp chuyển gien, các nhà di
truyền thêm gien vào một plasmid trong một ống nghiệm.
Các plasmids có các đặc tính rất là bổ ích như
vectơ vô tính.
Các đặc tính này gồm có (1) kích thước nhỏ, làm cho DNA dễ phân
lập và sử dụng, (2) DNA vòng, làm cho DNA ổn định hơn trong khi
phân lập hóa chất; (3) xuất xứ không lệ thuộc của việc sao in
nên sự sao in của plasmid trong tế bào tiến hành không lệ thuộc
từ phương pháp kiểm tra nhiễm sắc thể trực tiếp; (4) nhân bội số
bản sao, nên chúng có thể hiện diện trong tế bào trong một số
lượng hoặc nhiều bản sao, làm cho sự khuếch đại DNA có thể; (5)
sự hiện diện của các dấu có thể chọn như là các gien kháng thuốc
kháng sinh, làm cho sự phát hiện và chọn các dòng vô tính chứa
plasmid dễ hơn.
Dù cho
các plasmids tiếp hợp với môi trường thiên nhiên thường được
chuyển giao bằng sự tiếp xúc tế bào -đối-tế bào, những vectơ vô
tính plasmid thường được làm biến đổi để phòng ngừa sự chuyển
giao chúng một cách tiếp hợp để hoàn tất sự ngăn cản sinh học.
Tuy nhiên, sự chuyển giao trong phòng thí nghiệm có thể nhận từ
sự biến đổi hay phương pháp 'electroporation' (phần 9.6p). Lệ
thuộc vào hệ thống sinh vật ký chủ /plasmid, sự sao in plasmid
có thể chịu sự kiểm tra tế bào chặt, trong trường hợp đó chỉ số
ít bản sao được thực hiện, hay dưới sự kiểm tra tế bào lỏng lẻo,
trong trường hợp đó một số lớn bản sao được thực hiện. Sự hoàn
tất số bản sao cao thường là quan trọng trong phương pháp nhân
giống vô tính gien, và bằng cách chọn hợp lý hệ thống sinh vật
ký chủ /plasmid và việc sử dụng phương pháp tổng hợp phân tử lớn
tế bào (cellular macromolecule), số lượng bản sao của plasmids
đến số lượng hàng ngàn mỗi tế bào có thể nhận. Một ví dụ của một
plasmid nhân giống vô tính thích hợp là pBR322, sao in trên
Escherichia coli (hình 10.1) (trang 360). Plasmid
pBR322 có một số đặc tính làm cho nó thích hợp như một phương
tiện chuyển tải vô tính (cloning vehicle). Điều này tương đối
nhỏ, chỉ 4361bp.
Điều
này được duy trì một cách ổn định trên sinh vật ký chủ của nó (Escherichia
coli) trên số bản sao tương đối cao, 20-30 bản sao mỗi tế
bào.
Điều
này có thể được mở rộng đến một số lượng rất cao (1000-3000 bản
sao mỗi tế bào, khoảng 40% bộ genome) bởi sự ức chế tổng hợp
protein của chloramphenicol.
Dễ phân
lập theo dạng siêu xoắn bằng cách sử dụng một số lượng lớn những
phương pháp giản đơn (xem hộp Khảo sát nucleic acid: Công cụ,
trong Chương 6).
Một số
lượng hợp lý DNA lạ có thể được chèn, dù cho các đoạn gen chèn
hơn kb dẫn đến tính bất ổn định của plasmid.
Chuỗi
base hoàn toàn của plasmid này đã biết, làm cho nó có thể đặt
các điểm ở đó enzim giới hạn có thể tác động.
Có
những điểm phân chia đơn đối với các enzim giới hạn khác nhau
như là Pst1, Sal1, EcoRI, HindIII, và BamHI. Quan trọng là chỉ
một điểm nhận biết đơn đối với ít nhất một enzim giới hạn có thể
sử dụng nên nghiệm thức với enzim đó mở plasmid đến một phân tử
tuyến tính dài hoàn toàn nhưng không cắt nó thành mảnh.
Điều
này có một gien mang tính kháng ampicillin trên sinh vật ký chủ
và một gien khác mang tính kháng tetracycline. Các điều này cho
phép chọn dễ dàng những sinh vật ký chủ chứa plasmid. Các điểm
được nhận biết bởi một số lượng enzim giới hạn trong một gien
này hay gien khác của các gien kháng này, tạo thuận lợi cho việc
nhận diện plasmids mang DNA vô tính (xem sau này).
Điều
này có thể được đặt trong các tế bào dễ dàng bởi sự biến đổi.
Việc sử
dụng plasmid pBR322 trong việc nhân giống vô tính gien được
trình bày trong Hình 10.2. Như đã thấy, điểm BamHI trong gien
đối với tính kháng tetracycline và điểm Pst1 trong gien đối với
tính kháng ampicillin. Nếu một mảnh DNA lạ được chèn vào một
trong trong số các điểm này, tính kháng kháng sinh có gien chứa
điểm này bị mất, một hiện tượng có tên là khử hoạt hóa chèn gien
(insertional inactivation). Sự khử hoạt hóa chèn gien được sử
dụng để phát hiện sự hiện diện của DNA lạ trong plasmid. Do đó,
khi pBR322 được tiêu hóa với Bam HI và được gắn với DNA lạ, và
biến đổi những dòng vô tính khuẩn sau đó phân lập, các dòng vô
tính này cả hai kháng ampicillin, và kháng tetracycline thiếu
DNA lạ (plasmid hội nhập vào các tế bào này biểu hiện DNA vectơ
quay vòng lại không nhặt DNA lạ.) Tuy nhiên, những tế bào này
vẫn kháng ampicillin nhưng cảm ứng với tetracycline chứa plasmid
có DNA lạ được chèn. Vì tính kháng ampicillin và tính kháng
tetracycline có thể được xác định một cách không lệ thuộc trên
đĩa aga, phân lập các vi khuẩn chứa các dòng vô tính mong đợi và
loại các tế bào không chứa plasmid có thể dễ được hoàn tất.
Các
vectơ nhân giống vô tính plasmid đầu tiên đã sử dụng là các
plasmids xảy ra tự nhiên. Plasmid pBR322 thể hiện một thế hệ
cuối của vectơ nhân giống vô tính tự chúng được xây dựng in
vitro. Gien kháng tetracycline của pBR322 đến từ một
plasmid, xuất xứ sao in từ một plasmid khác, và gien kháng
ampicillin từ transposon Tn3. (phần 9.10p). Hiện nay có ít thế
hệ mới của vectơ plasmid đã được chuyển gien để có những đặc
tính có ích hơn và giản đơn hơn để sử dụng. Những đặc tính mới
này phần lớn luôn bao gồm một polylinker hay điểm nhân giống vô
tính đa gien, một đoạn gien ngắn của DNA có nhiều điểm giới hạn
khác nhau, mỗi điểm riêng cho một vectơ. Polylinker này thường
được chứa trong một vùng mã của một gien ở đó sự khử hoạt hóa
chèn gen rất dễ theo dõi. Các đặc tính trên còn được tìm ra trên
vectơ thực thể khuẩn, và một ví dụ đặc biệt được trình bày trong
phần 10.3.
Phương
pháp nhân giống vô tính trên plasmids như là pBR322 là một
phương pháp đa năng và khá tổng hợp của việc sử dụng rộng trong
phương pháp chuyển gien đặc biệt là đoạn gien sẽ được nhân giống
vô tính khá nhỏ. Plasmids thường là những vectơ nhân giống vô
tính tốt nhất nếu biểu hiện gien vô tính là mong đợi (xem phần
10.7). Vectơ plasmid dựa trên vòng 2mm
(phần 10.7) còn có thể sử dụng để nhân giống vô tính trên men
Saccharomyces cerevisiae.
Câu hỏi
kiểm tra về quan điểm
Plasmids là các vectơ nhân giống vô tính vì chúng dễ phân lập và
tinh chế và có thể nhân giống đến số lượng bản sao cao trên các
tế bào khuẩn. Gien kháng kháng sinh của plasmid được sử dụng để
nhận diện tế bào khuẩn chứa plasmid.
1. Giải
trình tại sao tốt nhất là sử dụng một enzim giới hạn chỉ cắt
vectơ plasmid một lần?
2. Sự
khử hoạt hóa chèn gen là gì?
10.
3 Thực thể khuẩn Lambda như một vectơ nhân giống vô tính
Chúng
tôi đã trình bày sự việc là trong khi truyền chất đặc biệt (phần
9.7p) một số lượng gien ký chủ được trộn chung vào một bộ thực
thể khuẩn. Một pha được sử dụng như là một pha truyền chất đặc
biệt là thực thể khuẩn lambda (phần 8.12). Trong khi truyền chất
đặc biệt, lambda tác động như như một véctơ nhưng tái tổ hợp xảy
ra trong tế bào, không phải là trong ống nghiệm. Lamdba có thể
còn được sử dụng như là một vectơ đối với tái tổ hợp in vitro.
Điều này là một vectơ nhân giống vô tính đặc biệt vì di truyền
phân tử của nó được biết đến nhiều, điều này có thể giữ những số
lượng lớn DNA so với phần lớn plasmids, và DNA có thể được đóng
gói một cách hiệu quả trong hạt pha in vitro. Các điều
này có thể được sử dụng để lây lan các tế bào ký chủ thích hợp,
và sự lây lan hiệu quả hơn nhiều so với sự chuyển gien (
transfection). Lambda có một bản đồ di truyền phức tạp (Hình
8.26) và một số lượng lớn gien. Tuy nhiên, gien trung tâm thứ ba
của bộ genome lambda, giữa gien j và N, thì không cần và có thể
thay bằng DNA lạ.
Các pha
lambda biến đổi
Lambda
kiểu hoang không thích hợp như một vectơ nhân giống vô tính vì
điều này có quá nhiều điểm enzim giới hạn. Để tránh khó khăn
này, pha lambda biến đổi đã được tạo ra có thể sử dụng trong
việc nhân giống vô tính. Trong một bộ pha lambda biến đổi, cái
gọi là pha Charon, các điểm enzim giới hạn không mong đợi đã
được lấy đi bởi biến đổi điểm, mất đoạn, hay thay đoạn. Trên các
biến đổi chỉ có một điểm giới hạn đơn, một đoạn gien DNA lạ có
thể được chèn, nhưng trái lại trên các biến đổi có hai điểm, DNA
lạ có thể thay một đoạn gien đặc biệt của DNA lambda. Các biến
đổi sau có tên là các vectơ thay (replacement vectors), đặc biệt
có ích trong việc nhân giống vô tính các đoạn gien DNA lớn.
Hình
10.3 (trang 362) cho biết một số đặc tính chính của lambda kiểu
hoang và hai vectơ Charon. Nhưng trái lại lambda kiểu hoang có
năm điểm EcoRI, Charon 4A chứa ba và Charon 16 chỉ một. Charon
4A được sử dụng như một vectơ thay; hai đoạn gien trong nhỏ bị
cắt rời và loại bỏ trong khi nhân giống vô tính. Với Charon 16,
DNA vô tính được chèn vào tại điểm EcoRI đơn. Cả hai Charon 4A
và 16 chứa các mất đoạn (không được trình bày trong Hình) không
chỉ lấy đi một số điểm được tìm ra trong lambda kiểu hoang mà
còn làm cho bộ genome nhỏ đi. Điều này cho phép nhân giống vô
tính các đoạn gien DNA lớn hơn.
Cả hai
vectơ còn chứa các biến đổi thay (substitution mutations), được
trình bày trong hình 10.3. Một trong các trường hợp thay là gen
đối với
b-galactosidase.
Khi các vectơ sao in trên một dòng âm tính lactose (Lac-)
Escherichia coli,
b-galactosidase
được tổng hợp từ gen pha (phage gene) và sự hiện diện của các
tấm (plaques) dương tính lactose (Lac+) có thể được phát hiện
bằng cách sử dụng một aga chỉ thị màu (xem phần 10.4). Nếu một
gien lạ được chèn vào gen
b-galactosidase,
tính trạng Lac + bị mất đi. Các tấm Lac - có thể dễ được phát
hiện như các tấm không màu giữa một nền của các tấm màu.
Các bước
nhân giống vô tính với Lambda
Việc
nhân giống vô tính với các vectơ thay liên quan đến những giai
đoạn sau (Hình 10.4):
Sự phân
lập vectơ DNA từ các hạt pha đến sự tiêu hóa với enzim giới hạn
thích hợp.
Sự nối
tiếp của hai đoạn gien lambda với đoạn gien của DNA lạ bằng cách
sử dụng DNA ligase. Các điều kiện được chọn nên phân tử được tạo
ra có một độ dài thích hợp để đóng gói thành các hạt pha.
Sự đóng
gói DNA bằng cách thêm vào chất chiết xuất của tế bào có những
proteins đầu và đuôi và cho phép tạo ra những hạt pha có thể
sống.
Sự lây
lan của E. coli và sự phân lập của các dòng vô
tính của pha có thể nhặt các tấm trên một dòng ký chủ.
Việc
kiểm tra pha tái tổ hợp đối với sự hiện diện của chuỗi DNA lạ
mong đợi bằng cách sử dụng các phương pháp chọn tạo nucleic acid
hay khảo sát các đặc tính di truyền.
Sự chọn
lọc các tái tổ hợp ít là một vấn đề với các vectơ thay lambda
(như là Charon 4A) so với các plasmids vì (1) hiệu quả của việc
chuyển giao DNA tái tổ hợp vào trong tế bào bởi lambda thì rất
cao, và (2) các đoạn gien lambda không nhận DNA mới lại quá nhỏ
để đưa vào các hạt pha.
Các vectơ
khác
Dù cho
lambda là một vectơ vô tính có ích, có các giới hạn về có thể
chèn được nhiều DNA. Khả năng sống của hạt pha thì thấp nếu DNA
dài hơn 105% DNA lambda thường, và một số gien lambda không thể
bị loại và vẫn duy trì khả năng sao chép của vectơ. Vì vậy, các
đoạn gen DNA thật lớn (lớn hơn 20kb) không thể được nhân giống
vô tính một cách hiệu quả
Cosmids
Một
kiểu vectơ có liên quan sử dụng gien lambda đặc biệt có tên là
cosmid. Cosmids là các vectơ plasmid chứa DNA lạ cộng chỉ với
điểm cos (đầu dính = cohesive end) của bộ genome lambda. Các
điểm có này là cần cho việc đóng gói DNA thành virions lambda.
Cosmids được xây dựng từ plasmids chứa DNA vô tính bằng cách cột
vùng cos lambda vào plasmid DNA. Plasmid biến đổi có thể sau đó
được đóng gói thành virions lambda in vitro như đã trình
bày trước, và các hạt pha được sử dụng để truyền tính trạng
Escherichia coli. Việc tạo ra cosmid không cần biến
đổi E. coli, tốt nhất là một qui trình không hiệu
quả (Phần 9.6P).
Một ưu
thế chính của những cosmids là chúng có thể được sử dụng để nhân
giống vô tính các đoạn gien lớn DNA. Vì vậy, số lượng ít dòng vô
tính cần để nhận biểu hiện của toàn thể yếu tố di truyền. Điều
này có ích đặc biệt trong việc nhân giống vô tính gien của nhiễm
sắc thể chân hạch (eukaryotic), ở đó lượng lớn DNA có liên
quan. Một ưu thế khác của cosmid là DNA có thể được tồn trữ
trong các hạt pha thay vì trên plasmids. Hạt pha ổn định hơn
nhiều so với plasmid, và vì vậy DNA tái tổ hợp có thể bị giữ
trong tời gian dài (ngân hàng gen).
Câu hỏi
kiểm tra về quan điểm
Những
thực thể khuẩn như là lambda đã được sửa đổi để tạo ra các vectơ
[nhân giống vô tính có ích. Những số lượng lớn DNA lạ có thể
được nhân giống vô tính với lambda với nhiều plasmids. Ngoài ra,
DNA tái tổ hợp có thể được đóng gói in vitro để chuyển
giao hiệu quả cho một tế bào ký chủ. Những vectơ plasmid chứa
điểm cos lambda có tên là cosmids, và chúng có thể mang một đoạn
gen lớn DNA lạ.
Tại sao
khả năng đóng gói DNA tái tổ hợp trong một ống nghiệm có ích?
Vectơ
thay là gì?
Các vectơ
khác C
Một số
các vectơ khác đã được triển khai là có ích cho các mục đích
khác nhau trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Có thể hiểu được là
trong các giai đoạn triển khai công nghệ DNA tái tổ hợp, những
vectơ được sử dụng là những vectơ được sử dụng phổ biến nhất
trong những kiểu nghiên cứu di truyền khác. Tuy nhiên, không cần
phải theo đuổi là một hệ thống di truyền có ích trong nghiên cứu
cơ bản tự động cung cấp hệ thống tốt nhất cho việc phát triển
một véc tơ nhân giống vô tính. Ngoài ra, thỉnh thoảng vectơ cần
áp dụng đặc biệt vượt quá yêu cầu đối với việc nhân giống vô
tính giản đơn một đoạn gien DNA. Trong phần này, chúng tôi trình
bày ngắn gọn một số các kiểu vectơ khác và mô tả một số biến đổi
có ích.
Một lớp
quan trọng của các vectơ mới được phát triển, có tên là vectơ
biểu hiện (expression vectors), được sử dụng khi mong đợi nhận
sự tổng hợp protein mã hóa bởi gien lạ vô tính vào vectơ. Chúng
tôi trình bày vectơ biểu hiện trong phần 10.7. Liên quan đến các
vectơ biểu hiện là vectơ bài tiết (secretion vectors), trong đó
sản phẩm protein không chỉ được thể hiện mà còn bài tiết (thải
ra) từ tế bào. Trên các vectơ này, gien được nhân giống vô tính
nên protein được biểu hiện mang một chuỗi tín hiệu (a signal
sequence) (Phần 6.9).
Về một
số lý do điều có ích là có thể chuyển di DNA giữa giữa các sinh
vật hoàn toàn không liên quan. Để chuyển di DNA giữa các sinh
vật không liên quan, một vectơ con thoi (shuttle vector) được sử
dụng. Một vectơ con thoi là vật có thể sao in thành hai sinh vật
khác nhau. Giống như hầu hết các vectơ chuyên tính, các vectơ
con thoi tự chúng được xây dựng bằng cách sử dụng các phương
pháp DNA tái tổ hợp. Các vectơ con thoi đã được phát triển sao
chép trên cả hai Escherichia coli và
Bacillius subtilis, E. coli và men và
E. coli và tế bào động vật có vú, cũng như trên nhiều
cặp sinh vật khác.
Vectơ để tạo chuỗi DNAV: thực thể khuẩn (bacteriophage) M13
M13 là
một pha có sợi chứa DNA có sợi đơn và sao in không không tiêu
diệt sinh vật ký chủ của nó. (Phần 8.10 P). Các hạt trưởng thành
của M13 được thả từ tế bào ký chủ bởi một qui trình nảy chồi
(budding), và có thể nhận môi trường cấy bị nhiễm có thể cung
cấp thường xuyên nguồn DNA của pha. Một đặc tính quan trọng của
M13 là DNA có sợi đơn của nó. Trong phương pháp Sanger để phát
sinh chuỗi DNA (Làm việc với nucleic acid L: Công cụ, chương 6)
DNA có sợi đơn là cần và DNA được nhân giống vô tính thành M13
do đó cung cấp một nguồn sẵn DNA có sợi đơn này. Lại, DNA có sợi
đơn rất có ích như là một con dò để phát hiện những chuỗi
nuccleic acid khác trong những phương pháp chuyển giao như là
thấm Southern, và M13 cho phép sản xuất sẵn các con dò DNA có
sợi đơn.
Tuy
nhiên, để sử dụng M13 cho việc nhân giống vô tính, một dạng có
sợi kép phải là có thể sử dụng vì các enzim giới hạn chỉ làm
việc trên DNA có sợi kép. M13 DNA có sợi kép có thể nhận từ tế
bào bị lây nhiễm vì M13 sao chép trên vật ký chủ như là một dạng
sao có sợi kép (Phần 8.10P).
Hầu hết
bộ genome của kiểu hoang M13 chứa thông tin di truyền cần cho
việc sao in vi khuẩn. Tuy nhiên, có một vùng nhỏ có tên là chuỗi
khác gien (intergenic sequence) có thể được sử dụng như một điểm
nhân giống vô tính. Những độ dài thay đổi của DNA lạ, đến khoảng
5kbp (kilobase pairs), có thể được nhân giống vô tính mà không
ảnh hưởng đến khả năng sống của pha - khi bộ genome trở nên lớn
hơn, virion (virut trưởng thành) dài hơn. M13mp18 là một chất
dẫn xuất của M13 trong đó vùng khác gien đã được biến đổi để
tạo thuận lợi cho việc nhân giống vô tính. Một bản đồ của vectơ
này được trình bày trong Hình 10.5a.
Một
trường hợp sửa đổi là việc chèn một đoạn gien hoạt động của
lacZ, gen Eschirichia coli mã enzim
b-galactosidase.
Vì vậy, các tế bào bị lây nhiễm M13mp18 có thể dễ được phát hiện
bởi màu sắc của chúng trên các đĩa chỉ thị (Hình 10.5b). Gen
lacZ này chính nó biến đổi để chứa đoạn gien DNA 54bp có tên là
polylinker. Polylinker chứa nhiều điểm giới hạn độc nhất trên
M13 và vì vậy có thể được sử dụng để nhân giống vô tính.
Polylinker được chèn vào đầu phần mã của gen lacZ. Đoạn gien
chèn nhỏ này trong khung (in-frame) và 18 amino acids phụ không
ảnh hưởng đến hoạt động của enzim được mã bởi gen. Tuy nhiên,
việc chèn DNA phụ vào polylinker trong khi nhân giống vô tính
không kích hoạt gen . Pha chứa đoạn gen DNA chèn phụ làm tăng
các tấm không màu, và vì vậy rất giản đơn để nhận dạng dòng vô
tính (Hình 10.5b và c). Những sinh vật tạo ra tương tự được sử
dụng trên các vectơ nhân giống vô tính để cho phép nhận diện
những tế bào chứa DNA vô tính.
Sau đó
các vectơ được sử dụng như thế nào trong việc nhân giống vô
tính? DNA có sợi kép sao được phân lập khỏi sinh vật ký chủ bệnh
và được xử lý với một enzim giới hạn. DNA lạ, cũng có sợi kép,
được xử lý với cùng enzim giới hạn. Khi cột, các phân tử M13 có
sợi kép nhận được chứa DNA lạ. Khi các phân tử này được đưa vào
trong tế bào bằng cách biến đổi, chúng sao và vừa lúc tạo ra
thực thể khuẩn trưởng thành chứa các phân tử DNA có sợi đơn. Chỉ
một sợi DNA được đóng gói thành pha trưởng thành. Sợi nào trong
số hai sợi lạ pha trưởng thành chứa lệ thuộc vào sự định hướng
theo đó sợi được chèn. Vì DNA lạ có thể được chèn (trong các
phân tử pha riêngt) theo bất kỳ hướng, cả hai sợi của DNA lạ có
thể được nhân giống vô tính.
M13 DNA
có sợi đơn chứa DNA lạ có thể sau đó được sử dụng trong việc tạo
chuỗi DNA. Vì chuỗi base ở đó DNA lạ được chèn đã biết (dựa trên
chuyên tính của enzim giới hạn được sử dụng), có thể sử dụng một
oligonucleotide tổng hợp bổ sung cho vùng này như là một con mồi
(primer) và do đó xác định chuỗi của toàn bộ DNA cuối nguồn từ
điểm này. Theo phương pháp này, chất dẫn xuất M13 đã chứng tỏ
cực kỳ có ích trong việc tạo chuỗi DNA lạ, ngay cả các phân tử
khá dài. (Chuỗi của toàn bộ thực thể khuẩn lambda DNA, 48, 514
bases dài, được xác định khá nhanh khi sử dụng một thư viện gien
được tạo ra trên một vectơ M13). Một hệ thống thay đổi để tạo ra
DNA có sợi đơn đã được tạo ra bằng cách đặt một xuất xứ M13 của
sao in vào trong một vectơ plasmid. Các plasmids này có thể được
sử dụng trong việc thao tác di truyền theo phương pháp thường,
và DNA có sợi đơn có thể được tạo ra theo sở thích bằng cách lây
lan các tế bào chứa một plasmid như trên với một pha hỗ trợ M13.
Các
vectơ còn được tạo ra là các dòng lai giữa pha có sợi, giống như
M13, và một plasmid. Các vectơ trên có tên là phagemids. Chúng
chứa cả hai pha và xuất xứ plasmid của sao chép. Thường sao chép
là từ xuất xứ plasmid, nhưng khi một tế bào chứa một phagemid
(dạng pha) bị lây nhiễm với một pha kiểu hoang, xuất xứ pha trên
vectơ được sử dụng để tổng hợp DNA có sợi đơn từ vectơ (và dù
cho gen vô tính nào có thể mang). DNA có sợi đơn này được đóng
gói thành các vi rút trưởng thành (virions) và có thể dễ được
phân lập và sử dụng để tạo chuỗi. Thường, phagemids có thể ổn
định mang một đoạn gien lớn hơn của DNA vô tính nhiều hơn so với
một vectơ dẫn xuất từ M13 điển hình.
Các
nhiễm thể nhân tạo men và dự án về bộ genome của con người
Như đã
trình bày trong các Phần 10.2 và 10.3, các vectơ plasmids thường
chứa các vectơ DNA ít hơn vectơ lambda, và các vectơ lambda ít
hơn vectơ cosmid. Khi tạo ra các thư viện gien của khuẩn hay các
eukaryotes đơn, cac vectơ lambda hay cosmid có thể được sử dụng
và toàn bộ thư viện sẽ chứa hầu hết vài ngàn dòng vô tính khác.
Kích thước của một thư viện gien (số dòng vô tính) cần chứa một
bộ genome hoàn toàn của một sinh vật lệ thuộc vào cả hai kích
thước của bộ genome và kích thước của bộ gien chèn có thể đặt
trên vectơ. Nếu kích thước trung bình của một đoạn gien chèn là
20kb, sau đó sẽ cần nhiều dòng vô tính để tạo ra một thư viện
của một genome của động vật có vú điển hình (3 x 109
bp) so với một bộ genome của khuẩn (4 x 106 bp). Hiện
nay, có một cố gắng chung trong cộng đồng di truyền quốc tế để
vẽ bản đồ. nhân giống vô tính, và tạo chuỗi toàn bộ genome đơn
bội của con người - Dự án bộ genome của con người. Điều này rõ
là một sự hiểu biết rộng hơn về việc tạo chuỗi các nhiễm sắc thể
tiền hạch (prokaryotic) (Phần 9.10). Điều có ích trong một dự án
như trên là có một một vectơ nhân giống vô tính có thể giữ các
đoạn gien DNA rất lớn nên kích thước của thư viện gien đầu tiên
có thể bị giới hạn. Các vectơ trên đã được triển khai và có tên
nhiễm sắc thể nhân tạo men (YAC - yeast artificial chromosomes).
Các
vectơ này đã được tạo ra để sao in trên men giống như nhiễm sắc
thể thường, nhưng chúng có các điểm ở đó DNA có thể được chèn.
Để hoạt động giống như các nhiễm sắc thể chân hạch (eukaryotic)
thường, YACs phải có một xuất xứ sao in DNA, telomeres (đầu xa)
tại các đầu của nhiễm thể (Phần 6.3), và một centromere (đầu
giữa ) (bộ phận nhiễm thể cần cho việc phân ly trong khi nguyên
phân (mitosis). Chúng phải còn chứa một điiểm nhân giống vô tính
và một gien có thể được sử dụng để chọn sau khi biến đổi thành
sinh vật ký chủ. Hình 10.6 cho thấy một sơ đồ của vectơ YAC
trong đó DNA lạ đã được nhân giống vô tính. Các vectơ YAC chính
chúng chỉ khoảng 10kbp, nhưng chúng có thể có 200-800kbp DNA vô
tính được chèn. Sau khi nhận diện một gien hay vùng đặc biệt
trên DNA vô tính, gien này có thể nhân giống vô tính phụ thành
một vectơ plasmid hay thực thể khuẩn để phân tích chi tiết thêm.
Các
vectơ chân hạch eukaryotic khác
Thêm
vào các vectơ YAC đã được trình bày trước, chúng tôi đã đề cập
là các vectơ plasmid có thể sử dụng trên men Saccharomyces
cerevisiae (xem phần 10.2). Sự phát triển vectơ để sử
dụng trên eukaryotes, cùng giống qui trình trên prokaryotes, lệ
thuộc vào vấn đề khoa học các nhà di truyền học muốn hỏi hay các
mục tiêu thực tiễn của kỹ sư di truyền. YACs được sử dụng để
nhân giống vô tính các đoạn gien rất lớn của DNA, và các
plasmids, các đoạn gien rất nhỏ. Dù cho men là một sinh vật cực
kỳ quan trọng đối với cả hai nghiên cứu di truyền (phần 9.13) và
áp dụng thương phẩm (phần 12.12), thường là quan trọng để sử
dụng các eukaryotes khác như sinh vật ký chủ đối với DNA vô
tính. Nhiều vectơ nhân giống vô tính đã được triển khai đối với
nhiều eukaryotes khác nhau, gồm có thực vật (xem phần 10.14).
Phần
lớn những vectơ được sử dụng trên eukaryotes cao hơn là vectơ vi
rút. Vi rút DNA SV40 (phần 8.18), một vi rút tạo ra khối u trên
các sinh vật nguyên sinh (primates), đã được triển khai như là
một vectơ nhân giống vô tính trên các dòng cấy mô người. Vi rút
SV40 có DNA vòng có sợi kép, và toàn bộ chuỗi nucleotide đã được
biết. Các chất dẫn xuất của SV40 không gây khối u đã được triển
khai cho phép nhân giống vô tính các gien của động vật có vú, và
thể hiện của các gien này đã nhận được. SV40 hay các vectơ nhân
giống vô tính tương tự của động vật có vú phải chứng tỏ rất có
ích trong việc hiểu rõ những sự cố liên quan đến biểu hiện gen
trong các sinh vật phức tạp này.
Có
những vectơ của động vật có vú sử dụng adenovirus (phần 8.21) và
vaccinia virus (phần 8.20). Các vectơ vaccinia virus đã được sử
dụng trong việc phát triển các vaccines mới (xem phần 10.13).
Một số lớn các vectơ thể hiện eukaryotic đã còn được phát triển
và cần cho hai kiểu. Một kiểu được tạo ra để cho một protein đặc
biệt có những mục đích thương phẩm. Những chất dẫn xuất phát
sinh từ baculovirus, một virus DNA sao trên các tế bào để tạo ra
số lượng lớn sản phẩm của gien vô tính. Các vectơ biểu hiện khác
được triển khai nên một gien vô tính có thể được duy trì một
cách ổn định và biểu hiện trong một sinh vật hay mô, thường như
là một phương pháp tiếp cận gien liệu pháp (xem phần 10.15).
Retroviruses (phần 8.22) có thể được sử dụng để đưa gien vào các
tế bào của động vật có vú vì các virus này sao in qua một dạng
DNA được hòa nhập vào nhiễm sắc thể ký chủ.
Một
phương pháp tiếp cận có thể thực hiện nữa là sự phát triển những
nhiễm sắc thể nhân tạo của người M (HACs). Không giống như YACs,
mà mục đích đầu tiên là để mang các đoạn gien rất lớn của DNA,
HACs được thấy như là các vectơ phải được duy trì một cách ổn
định trong các tế bào của người và mang những gien có thể được
biểu hiện theo thời trang thường. Tuy nhiên, khả năng của HACs
để mang số lượng lớn DNA vô tính có thể là có ích vì sự hiện
diện của một số introns rất lớn tạo ra một số lượng gien người
thường và các vùng điều hòa rất lớn, trên một triệu bp trong
nhiều trường hợp.
10.5 Những sinh vật ký chủ cho những vectơ nhân giống vô tính
Những
đặc tính lý tưởng của một sinh vật ký chủ đối với các gien vô
tính là sinh dưỡng nhanh, có thể sinh dưỡng trong một môi trường
cấy rẻ tiền, không gây hại hay gây bệnh, có thể sử dụng DNA, và
ổn định trong môi trường cấy. Sinh vật ký chủ phải có những
enzims thích hợp để cho phép vectơ sao in. Những sinh vật ký chủ
có ích nhất để nhân giống vô tính là vi sinh vật sinh dưỡng tốt
và nhiều thông tin di truyền về nó có thể sử dụng, như là các vi
khuẩn Escherichia coli và Bacillus subtilis
và men Saccharomyces cerevisiae. Tuy nhiên, nhiều
câu hỏi khoa học cơ bản có thể được giải đáp chỉ trong trường
hợp DNA vô tính có thể trở lại loài sinh vật nguồn của chúng.
Điều này đặc biệt là đúng trong các khảo sát liên quan đến việc
điều hòa gen. Sau hết, nếu DNA tái tổ hợp chính nó đươc sử sử
dụng để điều trị các bệnh của người, sinh vật ký chủ phải là con
người.
Sinh
vật ký chủ tiền hạch (prokaryotic)
Dù cho
hầu hết việc nhân giống vô tính đã được thực hiện trên
Escherichia coli, đã thấy các điểm bất lợi trong việc sử
dụng sinh vật ký chủ này. Escherichia coli có các
cơ nguy để sản xuất qui mô lớn các sản phẩm phát sinh từ DNA vô
tính vì điều đã tìm ra trong đường ruột của người và gây bệnh
tiềm tàng. Lại, các dòng không gây bệnh tạo ra endotoxins có thể
lây nhiễm sản phẩm, tình huống đặc biệt tồi với các dược liệu có
thể chích tiêm. Sau hết, E. coli giữ các proteins
ngoại bào trong không gian tế bào chất ngoại vi (periplasmic
space), làm cho khó phân lập và tinh chế. Tuy nhiên, các dòng
E. coli biến đổi đã được mở rộng đối với nó phần lớn
những vấn đề này bị loại. Vì sự hiểu biết rộng về các môn di
truyền và hóa -sinh học, E. coli vẫn là sinh vật
chọn đối với hầu hết các khảo sát về nhân giống vô tính.
Sinh
vật có gam dương tính, Bacillus subtilis có thể
cũng được sử dụng như một sinh vật ký chủ. Bacillus
subtilis không gây bệnh tiềm tàng, không tạo ra
endotoxin, và bài tiết proteins vào trong môi trường. Dù cho
công nghệ để nhân giống vô tính trên B. subtilis
không được phát triển gần hay tốt như công nghệ đối với
Escherichia coli, các plasmids và phages thích hợp để
nhân giống vô tính đã được triển khai và biến đổi là một phương
pháp triển khai tốt trên B. subtilis. Tuy nhiên,
những điểm bất lợi sử dụng B. subtilis như là một
sinh vật ký chủ nhân giống vô tính hiện có. Tính bất ổn định
plasmid không phải là một vấn đề thật, và điều này khó duy trì
sao plasmid trên nhiều chất chuyển giao môi trường cấy. Lại, DNA
lạ được duy trì tốt trên các tế bào B. subtilis và
vì vậy DNA vô tính thường bị mất một cách không mong đợi. Thích
ứng một loại vi khuẩn để sử dụng như là một sinh vật ký chủ cho
các thí nghiệm nhân giống vô tính luôn không giản đơn.
Thường
các sinh vật được sử dụng như vật ký chủ để nhân giống vô tính
phải có các genotip đặc biệt có hiệu quả. Thí dụ, nếu vectơ mang
gen
b-galactosidase,
sau đó sinh vật ký chủ phải có một biến đổi trên gien này. Vì
M13 chỉ lây lan vi khuẩn có F. pili (các phần 8.10 và 9.8),
những sinh vật ký chủ với vectơ phát sinh từ M13 chứa plasmid F.
Các kiểu khảo sát này, và các khảo sát khác như là khả năng để
chọn các chất biến đổi, phải được giải trình xem là vật ký chủ
là prokaryotic hay eukaryotic.
Sinh
vật ký chủ chân hạch (eukaryotic)
Phương
pháp nhân giống vô tính trên vi sinh vật chân hạch (eukaryotic)
có một số lượng sử dụng quan trọng, đặc biệt là trong sự hiểu
biết về các chi tiết điều hòa gien trong các hệ thống chân hạch
eukaryotic. Men Saccharomyces cerevisiae nổi tiếng
về di truyền (phần 9.13p) và đang được khảo sát rộng như là sinh
vật ký chủ nhân giống vô tính. Các vectơ plasmids, cũng như
YACs, đã được triển khai đối với men, và biến đổi sử dụng DNA
chuyển gien có thể được hoàn tất. Khả năng để nhân giống vô tính
vật liệu di truyền thích hợp trên men sẽ thúc đẩy sự hiểu biết
của chúng ta về các hệ thống sao in và giải mã hoàn toàn của
eukaryotes và phải tạo ra một nền tốt hơn cho khảo sát cơ bản.
Đối với
nhiều mục đích, việc nhân giống vô tính gien trên các tế bào của
động vật có vú phải là có thể mong đợi. Các hệ thống cấy tế bào
của động vật có vú có thể được sử dụng theo nhiều phương pháp
như phương pháp cấy vi sinh và phải sử dụng rộng trong khảo sát
về di truyền người, ung thư, bệnh lây lan, và sinh lý. Ngoài ra,
DNA còn có thể được đưa vào tế bào người bằng transfection hay
electroporation. (phần 9.6).
Một ưu
thế quan trọng của tế bào eukaryotic như là sinh vật ký chủ đối
với vectơ nhân giống vô tính là chúng đã có chất RNA phức tạp và
các hệ thống xử lý hậu giải mã (posttranslational processing
systems) liên quan đến sản xuất các sản phẩm gien của sinh vật
cấp cao, và do đó các hệ thống này không phải được chuyển gien
vào vectơ như chúng cần được làm khi việc tạo ra sản phẩm mong
đợi sẽ được thực hiện trên một prokaryote (xử lý hậu giải mã,
nói riêng, có thể tạo ra một số vấn đề nhân giống vô tính phân
tử) (xem phần 10.10).
Một
điểm bất thuận của tế bào động vật có vú như sinh vật ký chủ là
chúng đắt tiền và khó sản xuất trong điều kiện đại trà và mức
biểu hiện gen vô tính thường thấp. Các dòng tế bào côn trùng
giản đơn hơn để sinh dưỡng và như chúng tôi đã trình bày, các
vectơ đã được triển khai từ một vi rút DNA của côn trùng,
baculovirus.
Câu
hỏi kiểm tra quan điểm
Giống
như các plasmids và viruses xảy ra tự nhiên, các vectơ có DNA vô
tính phải được đặt trên một sinh vật ký chủ tương thích để sao
in. Chọn sinh vật ký chủ còn lệ thuộc vào tính chất của khảo sát
sẽ được thực hiện với DNA vô tính. Vi khuẩn sinh dưỡng nhanh
giống như Escherichia coli thường được sử dụng như
sinh vật ký chủ, nhưng một số khảo sát đòi hỏi sử dụng sinh vật
chân hạch eukaryotic giống như men Saccharomyces
cerevisiae hay các tế bào động vật có vú cấy.
10.6 Phương pháp tìm ra dòng vô tính đúng
Một
bước quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp là việc tìm ra
dòng vô tính đúng trong số lượng hỗn hợp dòng vô tính được tạo
ra bởi qui trình DNA tái tổ hợp. DNA lạ được sử dụng trong qui
trình nhân giống vô tính chứa điển hình một số lượng lớn gen,
chỉ một hay vài trong số có thể là những gien đang quan tâm. Các
phần 10.3 và 10.4 đã trình bày làm thế nào người ta có thể chọn
sinh vật ký chủ có một vectơ plasmid bằng cách chọn một dấu
vectơ, như là tính kháng chất kháng sinh vì chỉ các tế bào này
tạo ra quần lạc khuẩn. Đối với các tế bào ký chủ chứa một vectơ
khuẩn, đơn giản chỉ tìm kiếm các tấm. Chúng tôi cũng đã trình
bày làm thế nào các quần lạc này có thể được chọn về các vectơ
chứa đoạn gien chèn DNA lạ bằng cách tìm kiếm khử hoạt hóa một
gien vectơ của một plasmid (xem Hình 10.2), hay về
b-galactosidase
(xem Hình 10.5). Tuy nhiên, người ta bị để lại sau đó với một
thách đố lớn nhất: chọn dòng vô tính có gien đang quan tâm. Các
phương pháp phải là có thể sử dụng để khảo sát các quần lạc
khuẩn hay tấm của các tế bào bệnh sinh dưỡng trên dĩa aga và
việc phát hiện số ít này chứa gen đang quan tâm. Đây là mục đích
của phần này để trình bày các phương pháp tiếp cận có thể để tìm
ra dòng vô tính đúng. Chúng tôi khảo sát đầu tiên tình huống
trong đó gien được biểu hiện (có nghĩa là, protein được tổng
hợp) trên sinh vật ký chủ nhân giống vô tính. Sau đó chúng tôi
trình bày tình huống, khá phổ biến, trong đó gien không được
biểu hiện và chúng tôi phải tìm kiếm về chính DNA.
Nếu
gien lạ được biểu hiện trên sinh vật ký chủ nhân giống vô tính
Nếu
gien lạ được biểu hiện (nghĩa là, sản phẩm protein được tổng
hợp) trên sinh vật ký chủ nhân giống vô tính, sau đó các phương
pháp có thể được sử dụng để tìm ra sự hiện diện của protein này
trong các quần lạc tái tổ hợp. Tự sinh vật ký chủ nhân giống vô
tính phải không tạo ra protein đang được khảo sát. Nếu chúng tôi
đang tìm kiếm các quần lạc hiếm trong đó protein này hiện diện.
Nếu protein là protein do sinh vật ký chủ nhân giống vô tính
thường tạo ra, sau đó sinh vật ký chủ đã sử dụng phải có khuyết
tật, có nghĩa là, biến đổi, về gien đang quan tâm. Sau đó, khi
gien lạ được đưa vào, biểu hiện của gien lạ này có thể được phát
hiện bằng cách bổ sung (complementation) (phần 9.5p). Nếu chức
năng là cần, một dòng vô tính bổ sung có thể được chọn, tạo
thuận lợi cho phương pháp rất nhiều. Rõ là, nếu sinh vật ký chủ
đã biểu hiện một protein với cùng hoạt động, sẽ có một nền hoạt
động lớn này chống lại điều protein tạo ra thông qua gien lạ
không thể được phát hiện. Nếu protein không được tạo ra thường
trên khuẩn ký chủ, khi đó sinh vật ký chủ có thể có khuyết tật
tự nhiên.
Trong
một số trường hợp các hoạt động mới này được biểu hiện và có thể
được khám phá. Một ví dụ nổi bật là việc nhân giống vô tính các
gien luciferase từ các loài bọ cánh cứng quang sinh học
(bioluminescent) khác nhau vào trong Escherichia coli;
trong bóng tối, các dòng vô tính rực sáng với màu sắc khác nhau
lệ thuộc vào kiểu luciferase hiện diện (Hình 10.7).
Kháng thể như một phương pháp khám phá protein
Nếu
protein không có hoạt động có thể khám phá dễ, khi đó một phương
pháp tiếp cận khác nhau là cần. Điều này liên quan đến việc sử
dụng một kháng thể như là một thuốc thử (reagent) chuyên tính về
protein đang quan tâm. Chúng tôi sẽ trình bày các kháng thể và
khả năng miễn nhiễm trong Chương 20. Đối với mục đích hiện nay
của chúng tôi, chúng tôi chú ý là một kháng thể là một protein
của huyết thanh được tạo ra bởi hệ thống của động vật có vú phối
hợp theo một chuyên tính cao với protein khác, antigen. Trong
trường hợp hiện nay, protein đang quan tâm là antigen, và
protein này được sử dụng để tạo ra một kháng thể (antibody) trên
một động vật thí nghiệm. Vì kháng thể phối hợp chuyên tính với
antigen, khi antigen hiện diện trong một hay nhiều quần lạc trên
dĩa, sau đó các vị trí của các quần lạc này có thể được xác định
bằng cách khảo sát liên kết của kháng thể. Vì chỉ một số lượng
nhỏ protein (antigen) hiện diện trong các quần lạc, chỉ một số
lượng nhỏ kháng thể liên kết, và vì vậy một phương pháp cảm ứng
cao để khám phá kháng thể liên kết phải là có thể sử dụng. Về
mặt thực hành, điều này được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ
thống liên quan đến một tác nhân bức xạ hay một tác nhân có một
enzim chuyên tính gắn với nó. Khả năng bức xạ có thể được phát
hiện bằng phương pháp bức xạ ký tự động (autoradiography) bằng
cách sử dụng phim -tia X. Các enzim được sử dụng qui đổi điển
hình một nền không màu thành một nền màu mà khả năng hấp thu có
thể được tính toán rất nhạy cảm. Các phương pháp nhạy cảm cực kỳ
trên để khám phá các antigens được trình bày chi tiết sau này
(phần 21.8).
Lưu ý
là phương pháp khám phá này liên quan đến việc sàng lọc mà không
phải là chọn lọc, và vì vậy hàng ngàn dòng vô tính phải được
khảo sát. Các dòng này có thể là các quần lạc chứa plasmids hay
tấm (plaques) chứa vi rút tạo ra các sản phẩm vô tính. Toàn bộ
phương pháp, việc sử dụng plasmids và phát hiện bức xạ, được
phác thảo trong hình 10.8a. Như đã thấy, phương pháp tạo tấm sao
(replica plating method) (hình 9.2) được sử dụng để tạo ra một
bản sao của tấm chủ, nhưng sự sao in được thực hiện trên một bộ
phận lọc màng và tất cả các sử dụng được thực hiện với bộ phận
lọc này. Sau khi các quần lạc sao đã sinh dưỡng, chúng được phân
giải để phóng thích protein (antigen) đang quan tâm. (Sàng lọc
về việc biểu hiện trên các vectơ phage loại giai đoạn này vì vi
khuẩn đã bị phân giải.) Kháng thể sau đó được thêm vào, và phản
ứng antibody -antigen cho phép tiến hành. Kháng thể không được
gắn bị rửa trôi sau đó, và một tác nhân bức xạ sau đó được thêm
nghĩa là chuyên tính với kháng thể. Một tấm phim tia X được đặt
trên bộ phận lọc và được tiếp xúc. Nếu một quần lạc bức xạ hiện
diện, một điểm trên phim tia -X sẽ được khảo sát sau khi phim
tia -X được rửa. Vị trí của điểm này trên phim tương ứng với một
vị trí trên đĩa chủ ở đó một quần lạc hiện diện tạo ra protein.
Quần lạc này sau đó có thể được lấy đi khỏi tấm chủ và được cấy.
Một
giới hạn của phương pháp này là một kháng thể phải là có thể sử
dụng nghĩa là chuyên tính protein đang khảo sát. Như chúng ta sẽ
thấy trong chương 20, kháng thể có thể là dễ được tạo ra bằng
cách tiêm protein vào trong một sinh vật, nhưng protein tiêm
phải là thuần chủng, nhưng trái lại nhiều hơn một kháng thể sẽ
được tạo ra. Do đó, ta phải tinh chế protein trước.
Con
dò (probes) nucleic acid: việc tìm kiếm gien chính nó
Giả
định là gien không được biểu hiện trên sinh vật ký chủ nhân
giống vô tính hay là không có thí nghiệm hay kháng thể có thể sử
dụng đối với sản phẩm gen. Làm thế nào ta có thể khám phá sự
hiện diện của nó trên quần lạc? Phương pháp tổng hợp nhất là sử
dụng một con dò nucleic acid chứa một phần chính chuỗi base của
gen đang quan tâm. Như chúng tôi đã trình bày (phần 6.2p) sự lai
tạo nucleic acid có thể được sử dụng như là một phương tiện
chuyên tính phát hiện polynucleotides có chuỗi chuyên tính. Hoặc
là DNA hay RNA có thể được sử dụng như là một con dò, thường với
phosphate bức xạ nhưng các phương pháp nonisotopic (không đồng
vị) đang được sử dụng ngày càng nhiều hơn, và cho phép con dò có
sợi đơn để lai tạo với nucleic acid có sợi đơn từ DNA vô tính.
Vì việc ghép đôi base bổ sung chuyên tính (specific
complementary base pairing), hai polynucleotides có sợi đơn sẽ
lai tạo chỉ trong trường hợp chúng có tính khá bổ sung. Bằng
cách sử dụng các điều kiện lai tạo thích hợp, có thể nhận liên
kết con dò bức xạ chỉ với nucleic acid đang quan tâm.
Phương
pháp trong đó một con dò nucleic acid có thể được sử dụng để
khám phá sự hiện diện của DNA tái tổ hợp trên các quần lạc được
trình bày trong hình 10.8b. Phương pháp, lai tạo quần lạc, một
lần nữa sử dụng phương pháp tạo tấm sao để tạo ra một bản sao
của tấm chủ trên một bộ phận lọc của màng. Cùng phương pháp có
thể được thực hiện với vectơ vi rút bằng phương pháp thấm các
tấm trên một màng.) Các tế bào trên bộ phận lọc được phân giải
tại vị trí phóng thích nucleic acid của chúng và để qui đổi DNA
dưới một dạng ó sợi đơn và cố định nó vào bộ phận lọc. Bộ phận
lọc này sau đó được xử lý với một con dò nucleic acid bức xạ
(hoặc là RNA hay DNA) để cho phép lai tạo, và sau khi lấy đi
nucleic acid bức xạ không gắn, bộ phận lọc là đối tượng của bức
xạ ký tự động. Sau khi phát triển, phim tia-X được khảo sát về
các điểm. Các diểm này tương ứng với các vị trí trên màng ở đó
con dò bức xạ lai tạo DNA từ một quần lạc đặc biệt. Các quần lạc
tương ứng với các điểm này sau đó được lấy đi và khảo sát thêm.
Một biến đổi của phương pháp này, tránh việc sử dụng một con dò
bức xạ, đã được triển khai với vi sinh học lâm sàng (phần
21.10).
Câu
hỏi kiểm tra về quan điểm
Các
phương pháp đặc biệt là cần để khám phá gien lạ trên sinh vật ký
chủ nhân giống vô tính. Nếu gien được biểu hiện, sự hiện diện
của protein lạ chính nó, như được khám phá hoặc là bởi hoạt động
của nó hay bởi phản ứng với các kháng thể chuyên tính, là bằng
chứng có gien hiện diện. Tuy nhiên, nếu gien không được biểu
hiện, khi đó sự hiện diện của nó có thể được khám phá bằng cách
sử dụng một con dò nucleic acid.
Việc sử
dụng các con dò nucleic acid lệ thuộc vào biểu hiện gen? Hãy
giải trình.
Tại sao
lại cần phân giải các tế bào chứa plasmids để phát hiện sản phẩm
của gien vô tính?
Vectơ biểu hiện (expression vectors)
Đối với
áp dụng thực tiễn điều cần là các hệ thống phải là có thể sử
dụng trong đó các gien vô tính có thể được biểu hiện. Các sinh
vật có các hệ thống điều hòa phức tạp và nhiều gien không được
biểu hiện tất cả thời gian (Chương 7). Một trong các mục tiêu
chính của phương pháp chuyển gien là sự phát triển vectơ trong
đó các mức cao biểu hiện gen có thể xảy ra. Một vectơ biểu hiện
là một vectơ không chỉ có thể được sử dụng để nhân giống vô tính
gien mong đợi mà còn chứa các chuỗi điều hòa cần nên biểu hiện
gien là đối tượng sử dụng thực nghiệm.
Trong
phần này chúng tôi sẽ nhấn mạnh các vectơ biểu hiện prokaryotic.
Tuy nhiên, vectơ biểu hiện cũng được sử dụng trên eukaryotes.
Các vectơ baculovirus và retrovirus mà chúng tôi đã trình bày
(xem phần 10.4) là vectơ biểu hiện, vì là các vectơ plasmid men.
Nhiều đặc tính của các vectơ biểu hiện eukaryotic và prokaryotic
giống nhau rất nhiều (và nhiều vectơ biểu hiện còn là vectơ con
thoi) Tuy nhiên, các chi tiết khác nhau vì có những khác biệt về
cấu trúc gien và một số mặt biểu hiện gien giữa prokaryotes và
eukaryotes (phần 6.1p).
Các
yêu cầu của một hệ thống biểu hiện tốt
Nhiều
yếu tố ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của một gien, và một vectơ
phải được tạo ra trong đó tất cả những vectơ này được kiểm tra.
Ngoài ra, một sinh vật ký chủ phải được sử dụng trên đó vectơ
biểu hiện hiệu quả nhất. Chúng tôi tóm tắt các yêu cầu chính của
một hệ thống tốt ở đây.
Số bản sao gien mỗi tế bào
Nói
chung, nhiều sản phẩm được thực hiện nếu nhiều bản sao của gien
hiện diện. Vì vậy, nếu các mức độ biểu hiện rất cao là điều mong
đợi, vectơ số bản sao cao, thí dụ, các plasmids nhỏ như là
pBR322, có giá trị. Thỉnh thoảng, vì mục đích nghiên cứu (hay
mục đích điều trị với vec tơ của động vật có vú) điều có thể
mong đợi là chỉ có một bản sao đơn của gien vô tính trong tế
bào. Đối với các trường hợp này, các vectơ hòa nhập (integrating
vectors) đã được triển khai nên gien có thể tái tổ hợp thành
nhiễm sắc thể ký chủ (host chromosome).
Lực
promoter và điều hòa
Đối với
các mức độ biểu hiện rất cao, điều cần là tạo ra mức mRNA cao.
Vùng promoter là vị trí tại đó sự liên kết của RNA polymerase
xảy ra lần đầu tiên (phần 6.6p), và promoter tại chỗ trên các
gien khác nhau thay đổi rất lớn trên lực liên kết RNA
polymerase. Trong khi tạo ra một hệ thống thực tiễn, điều quan
trọng là bao gồm một promoter mạnh trên vectơ thể hiện. Đối với
vi khuẩn, vùng DNA khoảng 10 và 35 nucleotides trước khi bắt đầu
sao in (có tên là vùng -10 và vùng –35) (Hình 6.24) quan trọng
đặc biệt trên promoter. Nhiều gien Escherichia coli
được kiểm tra bởi các promoters tương đối yếu, và các promoters
của eukaryotes và một số prokaryotes khác hoạt động kém hoặc
không hoạt động chút nào trên E. coli. Các
promoters của E. coli đã được sử dụng trong việc
tạo ra các vectơ biểu hiện gồm có lac (lac operon promoter), trp
(trp operon promoter), lac (một dòng lai tổng hợp của vùng –35
của trp promoter và vùng –10 của lac promoter), và lambda P1
(promoter lambda trái) (phần 8.12). Lưu ý là mỗi trong những
promoters trên có thể được điều hòa (cac phần 7.3, 7.5 và 8.12).
Trong hầu hết những trường hợp, điều quan trọng là có thể được
điều hòa biểu hiện của gien vô tính để tối đa hóa năng suất.
Chúng tôi sẽ trình bày chi tiết hơn sau này.
Một hệ
thống điều hòa mới đã được tạo ra bằng cách sử dụng promoter T7
thực thể khuẩn.và RNA polymerase. Khi T7 lây lan
Escherichia coli, nó mã RNA polymerase của chính nó,
chỉ nhận biết các promoters T7, kết thúc một cách
hiệu quả sự sao in sinh vật ký chủ (phần 8.11) Trên các vectơ
biểu hiện có thể kiểm tra sự biểu hiện các gien vô tính của một
promoter T7. Tuy nhiên, khi điều này được thực hiện,
cũng cần chuyển gien vào trong plasmid gen T7 RNA
polymerase. Gien sau được kiểm tra bởi một promoter dễ điều hòa
như là gien lambda hay lac. Biểu hiện của một hay nhiều dòng vô
tính xảy ra trong thời gian ngắn sau khi sao chép của T7
RNA polymerase đã được mở. Vì điều này chỉ nhận biết các
promoters T7, T7 RNA polymerase chỉ sao in gien vô tính, tất cả
các gien ký chủ khác vẫn không được sao in.
Sự
bắt đầu giải mã
Để tổng
hợp protein của một mRNA, điều cần là ribosomes gắn tại một điểm
đúng và bắt đầu đọc trong khung đúng. Trên prokaryotes điều này
được kèm theo bởi một điểm liên kết (chuỗi Shine -Dalgarno)(
phần 6. 9) và một codon bắt đầu gần trên mRNA. Các điểm liên kết
của ribosome khuẩn không được tìm ra trên các gien eukaryotic,
và do đó điều cần là vùng khuẩn phải hiện diện trên gien vô tính
nếu mức độ cao biểu hiện gen sẽ nhận được. Một phần yêu cầu về
việc gắn kết ribosome thích hợp là cần một khoảng cách thích hợp
giữa điểm liên kết ribosome và codon bắt đầu giải mã
(translation initiation codon). Nếu các điểm này quá gần hay quá
xa gien sẽ được giải mã với hiệu quả thấp.
Trong
một số trường hợp ngay cả codon bắt đầu đối với gien sẽ được
nhân giống vô tính là bộ phận của vectơ biểu hiện. Vì phương
pháp DNA nguồn được hòa lẫn vào một vectơ như trên, ba khung đọc
có thể (phần 9.2) có thể nhận, chỉ một trong số là thỏa đáng.
Một phương pháp tiếp cận có thể được sử dụng nếu khung đúng
không biết là sử dụng ba vectơ, mỗi vectơ có điểm giới hạn trong
đó DNA mới sẽ được chèn tại vị trí để cho đoạn gien chèn sẽ ở
trong một khung đọc khác nhau. Đoạn gien được chèn vào tất cả ba
vectơ, và đoạn gien nào cho biểu hiện tốt được chọn bằng thí
nghiệm.
Sử
dụng codon
Có
nhiều hơn một codon đối với hầu hết 20 amino acids (Bảng 6.6),
và một số codons được sử dụng thường xuyên hơn các codons khác.
Việc sử dụng cođon một phần là chức năng của nồng độ. tRNA trong
tế bào. Một codon thường sử dụng trong một tế bào của động vật
có vú có thể được sử dụng ít thường xuyên trên sinh vật trong đó
gien đang được nhân giống vô tính. Sự chèn codon thích hợp có
thể là khó thực hiện vì có thể phải được thay đổi tại tất cả các
vị trí trên gien. Tuy nhiên, điều này có thể thực hiện khi cần
bằng cách sử dụng DNA tổng hợp và phát sinh biến đổi định hướng
điểm.
Tính
ổn định của protein
Một số
protein có thể dễ bị phân ly bởi các proteases nội bào và có thể
bị tiêu hủy trước khi chúng có thể được phân lập. Các protein
được tiết ra phải có chuỗi tín hiệu gắn kết (phần 6.9) nếu chúng
cần di chuyển qua màng tế bào chất. Một số proteins eukaryotic
có độc tố đối với vật ký chủ prokaryotic, và sinh vật ký chủ đối
với vectơ nhân giống vô tính có thể bị tiêu diệt trước khi một
số lượng đủ sản phẩm được tổng hợp. Việc chuyển gien thêm của
hoặc là sinh vật ký chủ hay vectơ có thể là cần để loại những
vấn đề trên.
Thường
có ưu thế là protein của dòng vô tính được tạo ra như là một sản
phẩm hòa lẫn với một protein được mã bởi vectơ. Điều này không
những ổn định protein mà có thể giản đơn hóa sự tinh lọc nếu
phần mã bởi vectơ là một protein đối với nó các phương pháp tinh
lọc rẻ tiền, giản đơn, nhanh đã được biết. Nhiều vectơ hòa lẫn
đặc biệt nay có thể sử dụng. Hình 10.9 cho biết một ví dụ về một
vectơ hòa lẫn cũng như là một vectơ biểu hiện.
Trong
một số trường hợp, protein mong đợi cũng có thể được lấy đi khỏi
protein hòa lẫn (fusion protein) bởi những phương tiện hóa. Các
hệ thống hòa lẫn có thể cũng được sử dụng về các mục đích khác
hơn hoàn tất tính ổn định protein gia tăng. Một ưu thế của việc
tạo ra một protein hòa lẫn là phần vi khuẩn có thể chứa chuỗi
khuẩn mã peptide tín hiệu tạo thuận lợi cho việc chuyển tải
protein qua màng tế bào chất (phần 6.9p), tạo thuận lợi cho việc
phát triển một hệ thống khuẩn không chỉ tổng hợp protein của
động vật có vú nhưng còn bài tiết nó thực sự.
Danh
sách này về các yêu cầu chắc chắn là không cạn kiệt, nhưng điều
này phải cho một khái niệm về các thách thức phải được thỏa mãn
trong việc tạo ra một vectơ biểu hiện thích hợp. Ngay cả với
vectơ được tạo ra tốt nhất, một số gien được biểu hiện kém trong
một tế bào đặc biệt. Trong một số trường hợp, những vấn đề này
có thể được chỉnh đúng bằng cách sử dụng một sinh vật ký chủ
biến đổi. Thí dụ, một số mRNAs phân ly rất nhanh trên kiểu hoang
Escherichia coli nhưng không trên các dòng biến
đổi đặc biệt. Trong các trường hợp khác, dòng vô tính chính nó
phải được sử dụng Nếu gien vô tính chứa introns (phần 6.7),
không sản phẩm protein sẽ được tạo ra nếu sinh vật ký chủ là một
prokaryote. Tuy nhiên, có các phương pháp né tránh vấn đề này
bằng cách tạo ra một gien không -intron (xem phần 10.10).
Vai
trò của bộ phận đóng mở điều hòa trên vectơ biểu hiện
Với
việc sản xuất tối đa của một protein của một gien vô tính,
thường là không mong đợi để tạo ra một vectơ cho phép gien sẽ
được sao in và giải mã tất cả thời gian. Có nhiều lý do về điều
này. Như đã được trình bày trước, một số proteins đang quan tâm
thương phẩm có độc tố với sinh vật ký chủ khuẩn. Ngoài ra, một
số hệ thống biểu hiện như là hệ thống liên quan đến promoter T7,
và mạnh đến nỗi gien ký chủ thường không thể được biểu hiện.
Trong những trường hợp này, điều rất có thể mong đợi là sự tổng
hợp protein dưới sự kiểm soát trực tiếp của các nhà nghiên cứu.
Tình huống lý tưởng là có thể sinh dưỡng môi trường chứa vectơ
thể hiện cho đến khi một quần thể lớn tế bào đã nhận, mỗi chứa
một số lượng sao lớn của vectơ, và sau đó mở biểu hiện trên tất
cả những bản sao đồng thời bằng cách thao tác của một bộ phận
tắt mở điều hòa.
Chúng
tôi đã trình bày kiểm tra điều hòa của thể hiện gien trong
chương 7. Nhắc lại tầm quan trọng chính của hệ thống ức chế
-điều hành trong việc điều hòa sao in gen (phần 7.3). Một bộ
phận ức chế mạnh có thể hoàn toàn ngăn cản sự tổng hợp protein
dưới sự kiểm tra của nó bắng cách liên kết với vùng điều hành.
Hoạt động ức chế có thể tắt vào thời điểm đã chọn bằng cách thêm
vật cảm ứng (inducer), cho phép sao các gien được kiểm tra bởi
bộ phận điều hoà (operator).
Đối với
hệ thống ức chế - điều hoà làm việc như là bộ phận tắt mở điều
hòa đói với việc sản xuất một protein lạ, vectơ biểu hiện phải
chứa operator được kiểm tra bởi repressor với nó gen vô tính
được hòa lẫn. Điều này cho phép sắp xếp thích hợp chuỗi yếu tố
di truyền: gien cấu trúc điểm liên kết promoter
-operator-ribosome, nên sao in hiệu quả và giải mã có thể xảy
ra. Trong hầu hết trường hợp, operator và promotor tương ứng cái
nọ với cái kia (thí dụ, lac operator được sử dụng với lac
promotor), nhưng điều này không luôn là trường hợp. Một vectơ có
thể dễ được tạo ra để chứa một trp promotor dưới sự kiểm soát
của một lac operator.
Đối với
các vectơ sử dụng lac operator, promotor được mở bởi các
inducers như là lactose hay
b-galactosides
(phần 7.3p). Đối với các vectơ sử dụng trp operator, sự cảm ứng
có thể mang lại bằng cách thêm vào một tryptophan tương đương
(như là
b-indolacrylic | 