Vì cây lúa là một cây trồng quan trọng nhất tại Nhật Bản, bệnh đạo ôn đã là bệnh cây trồng bị đe doạ nhất. Sự nhận diện đầu tiên về gen kháng đạo ôn trên cây lúa bởi Sasaki (1922), các nhà chọn tạo Nhật Bản đã quan tâm đến việc sử dụng gen kháng để bảo vệ cây trồng. Như là một gen kháng phát sinh từ indica cho biết tính kháng rộng và mạnh chống lại các dòng Nhật Bản, họ đã đưa một số gien từ giống trồng indica vào lại giống trồng ưu tú Nhật Bản từ thập niên 1930, và một vài NIL đã được triển khai (báo cáo của Kiyosawa 1980). Dù cho việc ứng dụng thực tiễn của các NIL này đã gặp phải nhiều trường hợp thoái hóa trong số ít năm, các điều này tạo ra một môi trường tốt để nhãn gien với dấu DNA, và chúng tôi có nhãn thành công các gen Pi -b (Miyamoto et al. 1996) và Pi -ta² (Rybka et al 1997) với các dấu cùng phân ly và cắt ngang sườn trong thời gian khá ngắn.

Mới đây, việc vô tính theo vị trí đã trở thành phương pháp hiệu quả nhất để vô tính gen không có yếu tố chính sinh hoá cho việc vô tính thường, do các tiến bộ trong các phương pháp xây dựng thư viện genome và tạo ra các dấu khác nhau như là RAPD và AFLP. Dù cho một vài gen kháng đã được vô tính bằng cách nhãn và vô tính theo vị trí (Baker et al. 1997), không có gen kháng đạo ôn trên cây lúa đã được vô tính. Việc vô tính các gien kháng thật là cần để hiểu rõ cơ chế nhận biết cây trồng của tác nhân lây lan, và sự lây lan của các gen bảo vệ đa dạng. Gen vô tính cũng sẽ góp phần để xây dựng “dòng nhiều yếu tố” (multi-lines) của NIL có gen kháng khác nhau trong thời gian ngắn.

Chúng tôi đã xác lập một khung làm việc rất đa dụng để vô tính theo vị trí trên cây trồng gồm có lúa bằng cách xây dựng:

1) một thư viện BAC (Bacterial Artificial Chromosome= nhiễm thể nhân tạo vi sinh) chất lượng tốt của cây lúa có kích cỡ đoạn gen chèn trung bình khoảng 160 kB, và độ che phủ 7 genome tương đương (Nakamura et al. 1997), 2) một vectơ nhị nguyên có sức chứa cao pBIGRZ có thể giữ và chuyển hiệu quả hơn 40 kB đoạn gen chèn trong T -DNA đến cây lúa mà không sắp xếp lại và có tính hữu thụ tốt (Akiyama et al đang in).

Như một trường hợp ứng dụng kiểu mẫu của phương pháp này chúng tôi đã chọn vô tính Pi -b. Sử dụng các công cụ này, chúng tôi có thể chia khoảng các dấu cắt ngang sườn của Pi -b, cách xa 2,4 cM, với 4 bước vô tính, và sau đó vùng Pi -b bị thu hẹp thành một dòng vô tính BAC đơn 180 kB. Chúng tôi cũng có thể che phủ vô tính với vài dòng vô tính pBIGRZ phát sinh từ thư viện genome kháng của giống trồng với Pi -b. Một số vật tương ứng có triển vọng của gien kháng cũng được tìm thấy bằng cách mô tả đặc tính cDNA được hiển thị trong vùng. Khảo nghiệm bổ sung với tất cả các dòng vô tính nay đang được thực hiện.

2. Xây dựng thư viện BAC chất lượng cao của cây lúa

Như hầu hết tất cả các giống trồng Nhật Bản là japonica, để vô tính theo vị trí gen từ giống sự hiện diện của thư viện BAC chất lượng cao của japonica cv. là cần. Vì vậy, chúng tôi đã xây dựng một thư viện BAC từ các hạt nguyên sinh của lá xanh giống Shimokita với gen Pi -ta. Hạt nguyên sinh có ưu thế nhiều hơn so với nhân như là vật liệu để chế phẩm DNA nhiều hơn megabase. Vì không có cơ hội tấn công nuclease với DNA nhân nguyên vẹn, và không sợ lây lan polysacchyride có thể ức chế tiêu hoá số lượng bằng enzim ức chế cắt. Như vectơ BAC chúng tôi sử dụng pBACLAC, có lacZ của M13mp18 (Asakawa et al. 1997) mạnh hơn nhiều trong hoạt động enzim so với Bluescript. Điều này có thể phân biệt các khuẩn lạc xanh /trắng trong một ngày ở nồng độ thường của X -gal ngay với một sao đơn của BAC plasmid.

Hình 1. Thư viện BAC chất lượng cao của cây lúa. A: sự phân bố kích cỡ đoạn gen chèn (kB) của thư viện BAC japonica giống Shimokita. Kích cỡ đoạn gen chèn trung bình là 155 kB, che phủ 7 genome tương đương, lớn nhất của tất cả các thư viện BAC lúa đã báo cáo. B: Màng có mật độ cao của thư viện BAC có 3072 dòng vô tính, tương đương với 1 genome lúa. Thư viện được mở để sử dụng, liên hệ với chúng tôi bằng E -mail. 

Sử dụng vectơ và megabase DNA này chúng tôi có thể xây dựng một thư việc genome japonica giống Shimokita với Pi -ta. Kích cỡ đoạn gien chèn trung bình là 155 kB, và 21.504 dòng vô tính, 7 genome tương đương, dược sắp xếp trên 7 màng mật số cao kích thước microplate với 1 genome tương đương 3072 dòng vô tính (Nakamura et al. 1997; Hình 1A). Chúng được sắp xếp trên cấu hình 8 x 12 của 96 lỗ kích thước microplate (Hình 1B). Một vùng lỗ thích ứng với ma trận nhỏ 6 x 6  với 4 dòng vô tính của pFos 1 như là dấu vị trí không phản ứng lai với vectơ BAC. Việc phát hiện ECL thích nghi vì không cần tạo băng tín hiệu, và lập lại lai tạo nhiều hơn hàng tá lần.

3. Tạo khoảng cách xây dựng contig các dấu cắt ngang sườn của Pi -b

Các dấu cắt ngang sườn Pi -b tách riêng 2, 4 cM và dấu cùng phân ly được sử dụng để chọn các dòng vô tính BAC tương ứng, và 5-10 dòng vô tính được chọn đối với từng dòng vô tính. Sự sắp xếp của mỗi dòng vô tính trong một nhóm được ước tính từ phương pháp điện di CHEF (contour-clumped hexagonal electric field) của vật tiêu hoá Not 1, và được xác nhận bằng lai tạo của cả hai mẫu dò đầu của vô tính ngoài cùng của một nhóm đơn. Mẫu dò đầu được mở rộng bởi vectorette PCR (Riley et al 1990). Chỉ bốn bước là đủ để chia khoảng các dấu cắt ngang sườn RZ213 và G1234 (Hình 2), và khoảng cách cơ lý của chúng là 400 kB. Hai dấu cùng phân ly b -1, được phát sinh từ RAPD, và RZ123, một dấu Cornell, cả hai ở trên cùng đoạn gen Not 1.

Hình 2 Một contig (vùng tiếp giáp) của các dòng vô tính BAC che phủ vùng Pi -b bị cắt ngang sườn bởi cả hai dấu cạnh (side markers) Các dấu cắt ngang sườn từ xa 2, 4 cM được chia khoảng với bốn bước contig và cách xa 400 kB. Các mẫu dò đầu của 145G7, được mở rộng bởi vectorette PCR, và một  số đoạn gen nội của đoạn gen chèn, có hiệu quả như là các dấu RFLP để thu hẹp vùng Pi -b của dòng vô tính đơn.

Tỷ lệ các khoảng cách cơ lý / di truyền trong vùng này là khoảng 160 kB /cM, khoảng genome lúa tổng số, 300 kB/cM. Đây là trái ngược lớn so với trường hợp Pi -ta² nằm gần đoạn trung tâm của nhiễm thể 12, trong đó vùng tỷ lệ khoảng cách là 1000 kB /cM hoặc hơn thế (Nakamura et al. 1997). Hẳn là vị trí Pi -b trong vùng đoạn xa tâm của nhiễm thể có thể có liên quan đến tỷ lệ tái tổ hợp cao của vùng. Việc định vùng Pi -b với dầu đoạn xa tâm gần của nhánh dài nhiễm thể 2 cũng được hình dung bởi FISH (Nakamura et al 1997).

Mẫu dò đầu của dòng vô tính BAC 145G7 đụng bởi các dấu cùng phân ly có giá trị như là dấu RFLP, và được áp dụng để phân tích tái tổ hợp F₂S của dấu cắt ngang sườn. Như là kết quả, vùng Pi -b bị thu hẹp đến dòng vô tính đơn này 145G7 khoảng 180 kB (Hình 2).

4. Phương pháp chọn cDNA được hiển thị trong vùng Pi -b

Trong hầu hết các trường hợp của gien kháng vô tính, giống nhiễm giữ các đối tác tương ứng. Vì vậy, việc thanh lọc gien kháng ứng viên bằng cách sử dụng vô tính BAC của giống nhiễm có thể là một phương pháp tiếp cận có triển vọng. Khi một vùng Pi -b bị giới hạn ở một dòng vô tính đơn 145G7, sự chọn lọc cDNA hiển thị trên dòng vô tính này được khảo nghiệm với phương pháp lai tạo vô tính được triển khai bởi Hayashida et al (1995). Dòng vô tính BAC được chia cắt thành khoảng 1 kB bằng phương pháp âm thanh (sonication) và được liên kết lưỡng trị với hột latex thông qua glycidyl methalcrylate. Mặt khác, thư viện cDNA được xây dựng trong khoảng 1 kB kích cỡ trung bình, và được chèn trên pBR322, không đồng dạng với vectơ BAC. Các đoạn gen chèn được mở rộng PCR, lai tạo với latex BAC và sau đó thả sau khi rửa sạch. Các đoạn gen chèn thả được chèn lại vào pBR322 sau khi mở rộng lại với PCR.

Chúng tôi đã thanh lọc lần đầu 960 dòng vô tính và sau đó 11.000 dòng vô tính bằng phân tích trừ và 17 kiểu cDNA được nhận dạng bằng cách tạo chuỗi và lai tạo tương hỗ. Khi yếu tố nồng độ được ước tính là khoảng 160 lần, từ sự so sánh tỷ lệ các dòng vô tính dương giữa các thư viện gốc và phụ, sự thanh lọc này có thể là tương đương với sự thanh lọc 2 triệu dòng vô tính của thư viện thường. 17 dòng vô tính được mô tả đặc tính bằng phương pháp tạo chuỗi và một protein kinase Ser /Thr đồng dạng với gien Pto cà chua (Martin et al 1993) được tìm ra.

5. Vectơ nhị nguyên khả năng cao pBIGRZ và thư viện  genome hoạt động

Phương pháp tiếp cận cDNA không thể tin cậy hoàn toàn vì khả năng là không có đối tác đồng dạng trên dòng vô tính nhiễm và sự lệ thuộc của nó vào phản ứng PCR. Vì vậy, chúng tôi cũng đã dùng một phương pháp tiếp cận khác phân tích bổ sung sử dụng vectơ nhị nguyên khả năng cao để thu hẹp thêm vùng mục tiêu.Vì không có vectơ nhị nguyên khả năng cao thích hợp vào lúc đó, chúng tôi đã xây dựng một vectơ nhị nguyên trên cơ sở chuỗi pB1 có RK2 ori với số sao thấp (2-7) và có  thiết bị chia plasmid trên E. coli (Thomas và Smith 1986). Vì việc bảo quản gien chèn lớn trên Agrobacterium không đủ với gien chèn Ri ori được thêm vào để bổ sung việc bảo quản nó. Tính kháng Hygromycin B (HTP) và intron -GUS (Ohta et al. 1990) được sử dụng để chọn các biến đổi và kiểm tra biến đổi trên quá trình chọn lọc (Hình 3A). Vectơ có tên là pBIRGZ.

Hình 3  Vectơ nhị nguyên khả năng cao pBIGRZ. A: Xây dựng vectơ với lacZ như việc chọn dấu của gien chèn, Hind III, Spe 1, và Not 1 như là vị trí vô tính độc nhất. Tính kháng Hygromycon (HPT) cho việc chọn các biến đổi trên cây lúa, intron GUS để kiểm tra quá trình biến đổi. B: Southern blotting của gien genome 40 kB của con người được chuyển sang cây lúa với pBIGRZ bằng Agrobacterium cùng nuôi cấy (coculture). Chú ý là hầu hết không có tái tổ hợp DNA trong quá trình chuyển gen. Việc kiểm tra là sao đơn tương đương của tiêu hoá plasmid đầu. C: Các cá thể đồng huyết RI giữ mô hình gốc của gien chuyển. D: Các biến đổi của gien người 40 kB. Tính hữu thụ nhiều hơn 80%  và không có dị dạng về ngoại hình.

Biến đổi cây lúa bởi pBIGRZ với gien của genome người hơn 40 kB đã được thực hiện thành công với hiệu quả cao, 4-5 cây tái sinh mỗi dĩa 9 cm, và gien chèn biến đổi cho thấy hầu hết không tái sắp xếp (Hình 3B). Các gien chèn biến đổi được bảo quản ổn định với các cá thể đồng huyết RI và tính hữu thụ của biến đổi nhiều hơn 80%. Kết quả này tốt nhiều hơnío với kết quả của biến đổi hạt nguyên sinh.

Sử dụng vectơ này, gõ đơn của phương pháp điện hoá mô sẹo (stroke of electroporation) có thể tạo ra thư viện genome sẵn sàng bổ sung che phủ một bộ genome lúa ở kích thước gien chèn trung bình 50 kB, với hiệu quả 5x10⁶ vô tính /mg gien chèn DNA. Kích thước gien chèn này thích hợp tốt nhất với việc ức chế cắt vùng bằng sự bổ sung gien mục tiêu. Dù cho BiBAC được báo cáo khoảng cùng thời gian xây dựng của chúng tôi (Hamilton et al 1996), khảo nghiệm của chúng tôi xác nhận là lacZ sử dụng thân hữu như dấu chọn so với sucB và vị trí Hind III hiệu quả hơn Bam HI.

6. Vùng contig của dòng vô tính phát sinh từ BL -1 trên pBIGRZ, che phủ vùng Pi -b

Dù cho thư viện phụ cDNA chuyên tính vùng có ích để chọn dòng vô tính của thư viện genome cho ẩn trú Pi -b của Bl -1, sự hình thành contig không dễ trên vùng Pi -b do sự hiện diện của tiếng ồn đồng dạng trong bộ genome. Vì vậy, chúng tôi xây dựng đầu tiên contig và bản đồ chi tiết của vô tính BAC 145G7 của tiêu hoá tại chỗ của nó được chèn trong pBIGRZ. Một thư viện của kích cỡ gien chèn khoảng 50 kB dễ xây dựng so với thư viện BL -1, vì so sánh mô hình băng là đủ để xác minh sự trùng lắp vô tính. Sau khi hoàn tất bản đồ contig của vô tính 145G7, chúng tôi có thể sắp xếp các dòng vô tính chọn từ thư viện BL -1 dễ hơn so với bản đồ hướng dẫn. Sự tiếp cận giữa các dòng vô tính được xác nhận bởi Southern blotting. ở vùng cắt ngang sườn, hai bản đồ trùng lắp tốt, nhưng ở vùng giữa, có khác biệt lớn giữa hai bản đồ. (Hình 4). Các khác biệt này có thể phản ánh sự động viên bộ genome giống như điều này là cần để làm sáng tỏ sự tiến hoá của các gien kháng.

Hình 4  Các bản đồ contig của thư viện phụ pBIGRZ của vô tính BAC 145G7 và BL -1 với Pi -b. Dòng vô tính trên cạnh bìa (border sides) rất phổ biến trong khi dòng vô tính ở vùng giữa rất khác nhau về mô hình của chúng tiêu hoá Hind III. Một Ser /Thr-protein kinase ở trên vùng bìa trong khi một số thể tương ứng gen kháng (RGAs) ở vùng giữa. Tất cả các dòng vô tính phát sinh từ Bl -1 đang được biến đổi với lúa và trắc nghiệm bổ sung được thực hiện bằng cách chủng phun dòng đạo ôn.

Có các thể tương ứng gen kháng (RGA) với vị trí liên kết nucleotide ở giữa bản đồ, và Ser -Thr protein-kinase ở vị trí gần bìa. Tất cả các dòng vô tính đã được biến đổi thành Nipponbare có một hiệu quả tốt, và nơi ẩn trú các gen đã chọn của chúng (HPT) được kiểm tra bởi PVR. Kết quả khảo nghiệm bổ sung bởi lây lan một số dòng đạo ôn lúa có và không gien avrPi -b và sự xác minh gien bởi phân tích phân ly bằng thế hệ RI nay đang được tiến hành.

7. Kết luận

Phương pháp này vô tính theo vị trí trên cây trồng, gồm có 1) sự hình thành contig thư viện BAC và 2) sự bổ sung với vectơ nhị nguyên khả năng cao rất thay đổi với kiểu gen và thực vật bất kỳ. Điều này sẽ là phương pháp dễ nhất để sử dụng bổ sung các đột biến liệt, vì vô tính BAC có thể trực tiếp phục vụ như là nguồn gien hoạt động. Để khảo sát thực địa quá trình, nay chúng tôi đang xây dựng một thư viện genome lúa của pBIGRZ có kích thước gien chèn trung bình (khoảng 50 kB) để dễ thu hẹp vùng mục tiêu để sử dụng mở.

Cả đối với gien trội, việc sử dụng vô tính BAC để tham khảo sẽ tạo thuận lợi việc xây dựng contig -phụ s?n bổ sung rất lớn. Plasmid pBIGRZ cũng là thích hợp để tạo chuỗi gien chèn trực tiếp.

Ngày 26-08-2006

Trở về Trang Chính